离体肝切除联合自体肝移植大鼠模型的建立

刘文渊，张玉君，徐土炳，林 恒，别 平 (第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所，重庆400038;河北保定市663部队卫生队)

离体肝切术由德国汉诺威器官移植中心的Pichlmaryr等首先提出，并于1988年为1例胃平滑肌肉瘤肝脏巨灶转移的病人进行了全球首例体外肝切除自体余肝原位再植术［1］。由于自体肝移植技术为部分常规难以切除的肝胆肿瘤提供了新的治疗手段，缓解肝移植供肝短缺问题，故国内一些大的肝移植研究中心开展了该项手术方式，并对其大动物模型进行了研究［2，3］，由于大动物成本高，不能进行大样本量的系统研究，国内研究机构转而进行对大鼠自体肝移植模型进行摸索［4－8］，但是，以往国内建立的自体移植模型出发点都在于研究缺血再灌注的损伤作用，未能将离体肝切除后小体积自体肝脏植入的继发问题进行一并深入研究，所以我们认为大鼠离体肝切除联合自体肝移植模型的建立很有必要。我们经过不断的练习和改进，已成功地建立了稳定的大鼠离体肝切除联合自体肝移植模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 手术器材 YBWZ-12型微量输液泵，显微手术器械包，9－0丝线圈。1 mm的硬膜外麻醉导管，两端修剪成斜面。0.9%的氯化钠注射液(每ml灌注液中含肝素50 U，地塞米松20 μg)，乳酸钠林格液及直径为5 cm的平皿。

1.2 动物模型制作 采用封闭群SD雄性大鼠，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，重200－250 g，实验室清洁级饲养。60只大鼠全部术前禁食12 h，不禁水。大鼠术前0.5 h肌肉注射阿托品0.03 mg，乙醚吸入麻醉。

1.2.1 无损伤肝切取 取上腹部正中线直切口，剑突牵引，以自制拉钩牵引双侧肋弓，置腰垫，将肠袢移至腹腔外左侧，覆盖盐水纱布，远离肝脏剪断肝镰状韧带、冠状韧带，游离并双结扎离断左膈下静脉。游离门静脉直至脾静脉处，9－0丝线结扎幽门静脉。分离胆道，距离左右肝管汇合部1.5 cm处楔形切开胆总管向内置入长4－5 mm、外径1 mm的支架，9－0的丝线固定。剪开肝尾状叶的韧带和下腔静脉以及肾静脉表面的后腹膜及结缔组织膜，将右肾静脉至肝尾叶之间的下腔静脉完全游离，肝尾状叶后部穿线结扎右肾上腺静脉。9－0丝线结扎肝固有动脉，上方切断。检查所需用具后，血管夹夹闭肝下下腔静脉及门静脉，进入无肝期计时，于幽门静脉门静脉断端侧内注入2 ml室温0.9%的氯化钠注射液(每毫升灌注液中含肝素50 U，地塞米松20 μg)将肝内血管床残留血液驱回体循环。由左侧膈下向右置入沙氏钳，连同部分膈肌一起钳夹，注意不要钳夹肺组织并观察大鼠呼吸及心跳情况。沿膈肌环剪断肝上下腔静脉，幽门静脉断端处剪断门静脉，肝尾状叶与右肾静脉之间剪断肝下下腔静脉。

1.2.2 肝脏灌注及肝叶切除 将切下的供肝放入备有0－4℃的乳酸林格氏液直径为5 cm的平皿中，将套管针置入肝脏门静脉断端，9－0的丝线固定，以15 ml/h的速度注入4℃乳酸林格氏液5 min，冲洗肝脏并观察是否有冲洗液由肝上及肝下下腔静脉流出，直至肝脏变为土黄色。灌注同时按照Higgin’s法行70%肝脏大部分切除。

1.2.3 小体积肝自体肝移植 将30%剩余肝脏原位置入腹腔，在显微镜下用9－0的缝线单线连续缝合肝上下腔静脉，同时用50 U/ml肝素生理盐水充盈肝上下腔静脉以避免血凝块和气泡。相同方法缝合门静脉，松开门静脉及肝上下腔静脉的阻断夹，结束无肝期，肝脏立即变红。同法吻合肝下下腔静脉，胆管支架套接法重建胆管、9－0丝线环扎固定。检查腹腔内无活动性出血，血管、肝脏无扭曲后关腹，碘酒消毒切口。术后一般能自动翻身爬行，0.5 h后能饮水，12 h后开始进食。

1.2.4 术后管理及观察 术后对大鼠进行复温，保持室内温度为25℃单独置于笼中，自由饮用10%葡萄糖液，12 h后给予正常饮食。术后不予抗生素。术后前3 d精神略差，皮毛杂乱、进食减少、体重略下降，5 d后逐渐恢复正常。

2 结果

60只大鼠全部采用定型术式，肝上下腔静脉缝合时间为(5.78±0.93)min，肝下下腔静脉缝合时间为(4.91 ±1.14)min，门静脉缝合时间为(4.86 ±1.07)min，肝脏冷灌注时间 5 min，无肝期(20.14 ±1.53)min。手术成功率 91.7%(55/60)，1 周以上存活率80%(48/60)。术后24 h内死亡的5例大鼠中，术后1 h内因失血性休克死亡2例，为肝上下腔静脉后壁出血;1例因空气栓塞而死亡;2例因为肝脏灌注速度过快肝脏损伤严重3 d后死亡。术后1周内死亡的7例大鼠中，2例因肝功能衰竭死亡，3例在第11天因胆道梗阻死亡，2例术后腹胆道支架连接处有胆漏、形成胆汁性腹膜炎而死亡。术后24 h内成活的55只大鼠于术后2，6，24 h尾静脉抽血测肝功能，结果见表1。

表1 术后不同时间ALT和AST变化

3 讨论

大鼠离体肝切除联合自体肝移植模型不能仅仅当做大鼠肝切除模型和大鼠原位肝移植模型的简单结合，在其操作过程中有其独特的技术要点，自体肝移植直接限制了袖套技术的运用，导致所有离断血管必须全部连续缝合，而肝门阻断期间还需行肝脏灌注及大部分肝脏切除，大大提高了手术操作的难度。我们在不断练习和改进的基础上，建立了较稳定的大鼠肝移植模型。在实验中我们有如下的体会:①术中腰垫及自制拉钩的使用对手术视野的暴露极其重要，手术过程中根据不同的步骤调整腰垫及拉钩的位置可以达到最佳的暴露效果。②肝上下腔静脉上夹子时注意暴露出后壁膈肌，但不能夹得太多以免抑制呼吸;剑突牵拉力度要适中，如发现呼吸减慢，则先放松后再慢慢提起。③灌注要缓慢均匀，速度不宜过快，约维持在15 ml/h，灌注过快易于引起肝细胞水肿，灌注过慢则会引起灌注不足。经门静脉灌注1 min即可发现肝脏颜色变淡。灌注时将肝脏置于4℃乳酸钠林格液中，灌注满意的肝脏无水肿并保持原有质感，呈土黄色，肝叶边缘锐利。④下腔静脉及门静脉的吻合对显微外科技术要求相当高，要求在针距基本相等，缝合组织不宜过多或过少的基础上，保证吻合速度，不漏血漏气且无狭窄。出针要沿缝针弧度，不可扯拉以免撕裂血管。

总之，建立稳定的大鼠离体肝切除联合自体肝移植模型在自体肝移植术研究中具有重要作用，该模型可以单独反映小体积肝脏缺血再灌注损伤以及继发门静脉高压过程，而不用考虑移植免疫排斥反应;同时可以作为小体积异体肝移植的阴性对照研究。在不断地练习和经验总结中，对模型进行了很多细微的改进，明显减少了人为操作失误以及术后并发症的发生，终于建立了稳定的大鼠离体肝切除联合自体肝移植模型，为以后自体肝移植相关研究提供了有力的支持。

［1］ Pichlmaryr R，Rosse H，Hauss J，et al.Technique and preliminary results of extracorporeal liver surgery(bench procedure)and of surgery on the in situ perfused liver［J］.Br J Surg，1990，77(1):21－26.

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