基于中空纤维液相微萃取的黄酮类化合物测定

全 红，张 茜，陈 璇，白小红 (山西医科大学药学院药物分析教研室，太原 030001;通讯作者:Tel:0351－4690071;E－mail:bxh246@163.com)

黄酮类化合物(flavonoids compounds)具有广谱的药理活性如抗菌、消炎、降压、抗氧化、抗癌、防癌等作用。种类繁多，广泛存在于在蔬菜、水果、牧草及药用植物中。目前，黄酮类化合物的提取方法不仅费时，有机溶剂用量大，浓缩倍数小，而且提取到的有效成分较复杂，不利于中药中黄酮类化合物尤其是少量或微量黄酮类活性成分的分析和研究。中空纤维液相微萃取(hollow fiber liquid phase mircroextraction，HFLPME)技术于 1996年由 Jeannot和Cantwell提出［1］，具有有机溶剂用量少、简单、快速、富集倍数高、样品净化能力强，集提取、分离、浓缩于一体，并能适应复杂介质，痕量成分，特殊性质成分分析。HFLPME已经被成功地应用于环境分析［2，3］、饮料分析［4］、生物样品分析［5，6］和中药样品分析［7，8］中。本文以二氢杨梅素(dihydromyricetin)、杨梅素(myricetin)、漆黄素(fisetin)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、山柰素(kaempferide)、异鼠李素(isorhamnetin)和白杨素(chrysin)黄酮类化合物为模型化合物，以HFLPME作为中药样品的前处理技术，结合HPLC法成功地同时测定了中药侧柏中微量杨梅素、槲皮素、山柰素和白杨素成分的含量。

1 仪器、材料和试剂

1.1 仪器和材料 Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪。

聚偏氟乙烯(MOF 503，内径/外径:0.5/0.8 mm，孔径:0.2 μm)，聚醚砜(UEIS 503，内径/外径:0.8/1.3 mm，孔径:0.2 μm)和聚砜(UPIS 503，内径/外径:0.8/1.2 mm，孔径:0.2 μm)中空纤维均购自天津膜天膜工程技术有限公司，聚丙烯(PP内径/外径:0.55/1.2 mm，孔径:0.18 μm)中空纤维由天津大学海水淡化与膜技术中心提供。

1.2 试剂 槲皮素(批号:081－9003)和白杨素(批号:111701－200501)对照品由中国药品生物制品检定所提供，山柰素(批号:A0129)、杨梅素(批号:A0048)对照品由成都曼思特有限公司提供。侧柏购于太原市长城药店，产于山西运城地区。甲醇(山东禹王实业有限公司，色谱纯)，乙腈(山东禹王实业有限公司，色谱纯)，实验用水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱分离条件 采用 Eclipse XDB－C18柱(5 μm，150 mm × 4.6 mm i.d.，Agilent公司)，检测波长为300 nm，柱温35℃，进样量20 μl，流动相乙腈(A)－ 甲醇(B)－0.3%磷酸(C)用 0.45 μm 微孔滤膜过滤。梯度洗脱程序:0－3 min，35%B+65%C，1 ml/min;3－5 min，47%B+53%C，1 ml/min;5－8 min，26%A+21%B+53%C，0.6 ml/min;8－12 min，47%B+53%C，0.8 ml/min;12－15 min，60%B+40%C，1 ml/min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取一定量的对照品，配制二氢杨梅素、杨梅素、漆黄素、柚皮素和白杨素 600 μg/ml，槲皮素和山柰素 750 μg/ml，异鼠李素200 μg/ml的甲醇的对照品储备液，置于4℃冰箱保存。使用前用10－5mol/L盐酸配制成各黄酮类化合物浓度为5 μg/ml萃取混合工作液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取干燥侧柏药材，研细，过60目筛，精密称取3份各1 g，置于具塞锥形瓶中，加甲醇20 ml，称重，浸泡10 min，超声提取(功率100 W)30 min，于室温下用甲醇补足减失的重量。再加入5 ml 25%的HCl，回流30 min，冷却至室温后过滤，用甲醇定容至25 ml，待用。使用前取上述溶液10 ml于100 ml容量瓶中，用10－5mol/L盐酸稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.3 HFLPME实验步骤 将长约10 cm的聚偏氟乙烯中空纤维管用甲醇超声洗净吹干浸入正己醇30 s，待其孔隙充满正己醇后取出，然后将中空纤维折成U形，用注射器在纤维中注入正己醇。将中空纤维表面的正己醇擦干，并将其浸入到盛有5 ml微萃取混合工作液或样品工作液的小玻璃瓶中。开启磁力搅拌器，在1 500 r/min搅拌速度下萃取45 min，萃取结束后收集接受相于小烧杯中，并将正己醇挥干，加入50 μl甲醇溶解，进行HPLC分析。

2.4 HFLPME条件的优化

2.4.1 中空纤维种类对萃取效率的影响 考察了聚砜(UPIS503)、聚醚砜(UEIS 503)、聚偏氟乙烯(MOF503)和聚丙烯(PP)4种中空纤维作为有机溶剂载体对黄酮类化合物萃取效果的影响，结果见图1。由图1可知MOF503聚偏氟乙烯中空纤维萃取效率最高，因此本试验选用MOF503中空纤维作为有机溶剂支持体。

图1 中空纤维种类对萃取效率的影响Fig 1 Effect of hollow fiber types on the extraction efficiency

2.4.2 有机溶剂种类对萃取效率的影响 本实验考察了正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇和正癸醇等作为萃取相对黄酮类化合物萃取效率的影响。结果表明:正己醇较其他正构醇萃取效果稍好(见图2)。故有机溶剂选择正己醇。

图2 醇的种类对萃取效率的影响Fig 2 Effect of alcohol types on the extraction efficiency

2.4.3 供相溶液酸度对萃取效率的影响 由于黄酮类化合物为弱酸性，因此在供相中加入适当的酸有利于分析物以分子状态存在，增加其在有机相中的溶解度。本实验考察了在供相中加入不同浓度的盐酸对黄酮类化合物萃取效率的影响(见图3)。结果表明:当加入盐酸浓度为10－5mol/L时，黄酮类化合物萃取效果最好。故在供相中加入10－5mol/L盐酸。

图3 盐酸浓度对萃取效率的影响Fig 3 Effect of HCl concentration on the extraction efficiency

2.4.4 搅拌速度对萃取效率的影响 本实验考察了300，600，900，1 200，1 500 和1 800 r/min 时黄酮类化合物的萃取效率，结果见图4。由图4可知，当搅拌速度为1 500 r/min时，黄酮类化合物的萃取效率最大。故将搅拌速度确定为1 500 r/min。

图4 搅拌速度对萃取效率的影响Fig 4 Effect of stirring rate on the extraction efficiency

2.4.5 萃取时间对萃取效率的影响 液相微萃取过程是一个基于分析物在供相与有机相之间分配平衡的过程，分析物在萃取达平衡时，萃取效率最高。本实验考察了萃取时间分别为 15，30，45，60，90 min和120 min时黄酮类化合物的萃取效率，结果见图5。由图5可知，黄酮类化合物随着萃取时间延长萃取效率增加，在45 min时萃取基本达平衡。因此本试验选择萃取时间为45 min。

2.4.6 供相体积对萃取效率的影响 本实验考察了不同供相体积对分析物萃取效率的影响，见图6。由图6可知，黄酮类化合物在供相体积为5 ml时，萃取效率最大。故本实验选择供相体积为5 ml。

3 方法学实验

3.1 工作曲线的绘制 精密量取不同体积的混合工作液，制成分析物浓度分别为 0.01，0.05，0.1，0.3，0.5，1，5，10 μg/ml的系列溶液，按照 HFLPME实验步骤操作，HPLC检测，利用色谱峰面积y对分析物浓度c(mg/L)进行线性回归，结果见表1。

图5 萃取时间对萃取效率的影响Fig 5 Effect of extraction time on the extraction efficiency

图6 供相体积对萃取效率的影响Fig 6 Effect of donor phase volume on the extraction efficiency

表1 HFLPME-HPLC测定黄酮类化合物的工作曲线参数 (n=8)Tab 1 Parameters for determining the flavonoids compounds by HFLPME-HPLC (n=8)

3.2 精密度实验 分别准确吸取一定体积的混合工作液，制成 5.00，0.50，0.05 μg/ml高、中、低三种浓度的溶液，按照HFLPME实验步骤平行测定3次，日内精密度RSD＜8.0%，连续测定3 d，日间精密度 RSD＜10.0%。

3.3 回收率实验 分别精密称取5份已知准确含量的侧柏样品各1.00 g，准确加入不同量的对照品溶液，按照供试品溶液制备方法配制成加样回收率供试品溶液，按HFLPME实验步骤操作，平行萃取5次，侧柏中分析物的加样回收率见表2。

3.4 样品分析 按照2.3.3配制供试品溶液，经HFLPME－HPLC测得侧柏中微量黄酮类化合物的含量见表3，样品色谱图见图7。

4 结论

本文利用HFLPME作为中药的样品前处理技术，结合HPLC成功地测定中药侧柏中微量黄酮化合物杨梅素、槲皮素、山奈素和白杨素含量。HFLPME－HPLC操作简单、快速、富集倍数高、灵敏度高、净化能力强、有机溶剂用量少。该法的成功应用对常规前处理方法难以分析的少量、微量活性成分或有害成分的分析具有重要的意义。另外，聚偏氟乙烯中富电子的F与分析物中缺电子的苯环(取代基的吸电子影响)极易形成电荷转移超分子，使得被分析物在中空纤维膜表面聚集，增加了分析物在中空纤维表面的有效浓度，提高了分析物的萃取效率和浓缩倍数。因此，聚偏氟乙烯纤维在液相微萃取中的应用，不仅起到了有机溶剂支持体和微孔过滤的作用，而且还参与了分析物的萃取，对分析物的浓缩和萃取效率提高有一定贡献。

表2 侧柏中HFLPME-HPLC黄酮类化合物的加样回收率 (n=5)Tab 2 The sample recovery of flavonoids in Platycladus orientalis by HFLPME-HPLC (n=5)

表3 HFLPME-HPLC快速测定中药侧柏中微量黄酮类化合物含量Tab 3 Rapid determination of trace of flavonoids compounds in Platycladus orientalis by HFLPME-HPLC

图7 侧柏样品色谱图Fig 7 Chromatogram of Platycladus orientalis samples

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