大豆疫霉拮抗细菌B048液体发酵培养基的筛选与发酵条件的优化

汪 莞， 赵平生， 周 涛， 王子迎

（合肥师范学院生命科学系，安徽合肥 230601）

大豆疫霉拮抗细菌B048液体发酵培养基的筛选与发酵条件的优化

汪 莞， 赵平生， 周 涛， 王子迎

（合肥师范学院生命科学系，安徽合肥 230601）

通过单因子实验，筛选得到了适合大豆疫霉拮抗细菌B048液体发酵的最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为豆粕，最佳无机盐离子为氯化钠。通过正交实验确定了该培养基的最佳配比为：玉米粉5 g／L、豆粕15 g／L、氯化钠10 g／L。在确定适合该菌株的培养基组分基础上，对其培养条件进行优化，结果表明：初始p H值为6.0，培养时间为48 h，转速为180 r／min时为该菌株的最佳培养条件。

大豆疫霉；B048；培养基；发酵

大豆疫霉（Phytophthorasojae）侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害［1］，最早于1948年发生在美国，此后不断蔓延，现已广泛分布亚、非、欧、南北美洲的近二十个国家的大豆主要产区，每年给大豆生产带来的直接经济损失高达几十亿美元，成为大豆生产上最严重的病害［2，3］。该病菌于80年代后期首次在我国的东北地区发现，随后该病在我国北方的大豆主产区逐步扩展，目前已经成为黑龙江省大豆生产上的头号病害，每年造成巨大的经济损失［4］。90年代后期，在我国的局部大豆产区，也发现了大豆疫霉的传入，在条件适宜的年份，其造成的大豆产量损失高达50%以上［5－8］。

目前，大豆疫霉根腐病的防治方法主要是化学防治，其中使用最多的药剂是甲霜灵（Metalaxy，商品名Ridomil）。甲霜灵为内吸性杀菌剂，生物活性强，且效期持久［9］。但由于甲霜灵对病菌的作用位点单一，病原菌容易对其产生抗性突变，因此，开发新的替代防治方法在控制大豆疫霉根腐病上尤显重要［10］。在大豆疫霉根腐病的防治中，未见从土壤中筛选拮抗菌作为病害生防因子的报道。为可持续地控制大豆疫病，避免大豆疫病因单一的化学防治而过快地产生抗药性，生物防治已成为大豆疫病防治的重要研究领域。

为此，作者从大豆疫霉生存的土壤中筛选具有高拮抗活性和易定殖的生物防治菌株，分离到一株拮抗效果好的细菌，命名为B048。为实现该生防菌株的产业化，本文对该菌株的液体发酵培养基的筛选和发酵条件进行了优化研究，以期为该菌株的工业生产并获得高产抗菌物质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆疫霉生防菌B048由本实验室在土壤中分离得到，保存于本实验室。基础培养基和种子培养基为肉汤培养基（蛋白胨10.0 g／L、氯化钠5.0 g／L、葡萄糖5.0 g／L、牛肉浸出粉3.0 g／L）。

1.2 方法

1.2.1 种子菌液制备

无菌条件下，用接种环挑取少量大豆疫霉生防菌B048菌株，在肉汤培养基上划线，用封口膜封口后，放入37℃恒温箱中培养，48h后，得到活化的大豆疫霉生防菌B048菌株单菌落，然后挑取少量活化的大豆疫霉生防菌B048单菌落于肉汤培养基中，28℃、110 r／min条件下培养12 h，得到种子菌液。

1.2.2 活菌数计数

按平板菌落计数法计算活菌数：将种子菌液稀释至10－4－10－7，然后取100μL均匀涂布到肉汤培养基平板上，12 h后计算活菌数。

1.2.3 培养基组分的筛选

碳源筛选时，分别以含量为5 g／L的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖、D－果糖共6种碳源替代肉汤培养基中的葡萄糖，其他成分不变；氮源筛选时，分别以含量为15g／L的黄豆粉、豆粕、硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵共6种氮源替换肉汤培养基中的牛肉膏和蛋白胨；无机盐离子的筛选时，以优化的碳源与氮源制成液体培养基，然后在该培养基中分别添加5 g／L的MgSO4、KH2PO4、CaCO3，以不添加金属离子的培养基作为对照。将不同的培养基均用1 mol／L的HCl和0.1 mol／L的NaOH调至p H为7.5后灭菌20 min。无菌操作下每种液体培养基各倒三个250 mL锥形瓶，每个锥形瓶的装液量为150 mL，用接种环挑取少量的大豆疫霉生防菌B048，接种在摇瓶中，放入28℃的摇床上培养24 h。

1.2.4 最佳培养条件的筛选

确定最佳培养时间时，将菌株培养时间调节为12、24、36、48、60、72h；确定最佳培养基初始p H值时，用0.1 mol／L柠檬酸和0.1 mol／LNaOH将优化培养基p H值调节为4.0、6.0、7.5、9.0和11.0；确定最佳培养转速时，将摇床转速分别调整为60、120、180、240 r／min。每种液体培养基各倒三个250 m L锥形瓶，装液量为150 m L，接种后放入28℃的摇床上培养24 h。

2 结果与分析

2.1 培养基的优化

2.1.1 碳源

由图1可以看出，麦芽糖作为碳源时，B048的生长量最大，达到2.25×1010cfu／m L，其他碳源的菌株生长量大小依次为玉米粉、可溶性淀粉、D－果糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖，但由于麦芽糖的市场价格高于玉米粉，同时以玉米粉作为碳源的液体培养基的活菌数也不低，达到了1.77×1010cfu／m L，所以，综合菌株生长量和生产成本的便于获取和价格低廉，最终选择玉米粉作为大豆疫霉拮抗细菌B048的液体发酵培养基中的最佳碳源。

图1 不同碳源对大豆疫病生防菌B048生长的影响

2.1.2 氮源

由图2可知，黄豆粉作为氮源时，大豆疫霉拮抗细菌B048的液体发酵培养基中，活菌数最多，达到1.54×1010cfu／m L，其他氮源的菌株生长量大小依次为牛肉浸膏和蛋白胨、硝酸钠、豆粕、硫酸铵、硝酸钾和硝酸铵。另一方面，豆粕作为一种工业下脚料，便于获取且价格低廉，同时以豆粕作为氮源的液体培养基的活菌数也达到了7.7×109cfu·m L－1，所以，综合成本因素和培养效果的考虑，选择豆粕作为大豆疫霉拮抗细菌B048的液体发酵培养基中的最佳氮源。

图2 不同氮源对大豆疫病生防菌B048生长的影响

2.1.3 无机盐离子

以优化的碳源和氮源制成的液体培养基，分别加入等量的不同的无机盐离子，结果（图3）表明，Na＋能促进菌株生长，使菌株的生产量显著增加，K＋对菌株的生长影响不明显，Ca2＋、Mg2＋对菌株的生长有轻微的抑制作用，加入氯化钠作为无机盐离子的液体培养基，获得的大豆疫霉拮抗细菌B048的活菌数远高于加硫酸镁、磷酸二氢钾和碳酸钙作为金属离子的液体培养基，菌株生长量达到了2.85 ×109，所以选择氯化钠作为大豆疫霉拮抗细菌B048的液体发酵培养基中最佳的无机盐离子。

图3 不同无机盐离子对大豆疫病生防菌B048生长的影响

2.1.4 正交试验法优化筛选培养基各组分的配比

由表1和表2可知，不同水平的玉米粉对发酵液中活菌数有一定的影响，培养基中玉米粉的含量越低，发酵液中活菌数越多，反之越少，极差为111.8，中、高含量的玉米粉的发酵液中，活菌数的含量相差不大，豆粕含量适中时，活菌数含量最多，低或高的豆粕含量都会降低发酵液中的活菌数量，极差为154.7，氯化钠含量对发酵液中活菌数量的影响最大，极差达到了167.9，高含量的氯化钠会抑制菌株的活性，适中的氯化钠含量有利于活菌数的增加。

表1 3因素3水平的正交试验统计结果

表2 培养基各组分配比优化的正交试验活菌数评价结果（×107 cuf／m L）

2.2 培养条件的确定

2.2.1 培养时间

结果（图4）表明，菌株在培养36－48 h内，生长量呈明显上升趋势，48h时达最大值，活菌数最多，达到9.5×108，然后随着培养时间的延长（48－72 h），生长量呈明显下降趋势，因此，菌株以培养48h较为适宜。

图4 最佳培养时间的确定

2.2.2 转速

由图5可以看出，转速从120 r／min增加至180 r／min时，菌株的生长量显著增加，当转速继续增加时，菌株生长量明显下降，这说明转速影响着菌株B048的生长周期，当转速120 r／min时，培养48 h的B048细菌还处在对数期，当转速为180 r／min时，B048培养48 h就进入了生长衰退期，导致活菌数下降。因此其最适宜的转速为180r／min。

图5 最佳转速的确定

2.2.3 pH值

图6表明，在液体发酵培养基p H值为4.0—6.0时，菌株生长量呈明显上升趋势，在p H值为6.0时，最有利于菌株生长，活菌数达到3.15× 107，此后随着p H值增大，菌株生长量则明显下降，当p H为9.0—11.0时，几乎会抑制活菌数的含量，因此，可以判定，该菌株适合在中性的环境下生存。

图6 最佳p H值的确定

3 讨论

在用生物防治控制大豆疫霉根腐病方面，从土壤中筛选拮抗菌作为病害生防因子的方法，是非常有潜力的，自然环境是个巨大的微生物菌种库，而土壤则是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的拮抗菌种的主要来源。况福元等［11］从土壤中分离筛选获得2株解淀粉芽抱杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）对菜心炭疽病菌希金斯炭疽菌（Colletotrichumhigginsianum）具有强烈抑制作用；麦明晓等［12］从土壤中筛选出一株对香蕉的尖孢镰刀菌具有较强抑制作用的师岗链霉菌（Streptomycesmorookaense）；本实验的作者从大豆疫霉生存的土壤中筛选具有高拮抗活性和易定殖的生物防治菌株，分离到的一株拮抗效果相对最好细菌，命名为B048菌株。

通过单因素试验和正交试验相结合，初步得到了适合摇瓶条件下生防菌菌株发酵的液体培养基配方为：玉米粉5 g／L、豆粕15 g／L、氯化钠10 g／L；在最适培养条件为：初始p H值为6.0，培养时间为48 h，转速为180 r／min的条件下，生防菌B048的活10 g／L菌数高达4.63×109cuf／mL。多种拮抗菌己被证实对病原菌具有防治作用，且拮抗菌应用于病害防治有很多优点，例如，大豆疫霉拮抗细菌B048液体发酵培养基中使用的玉米粉和豆粕都是工业下脚料，便于获取且价格低廉，为该菌株的工业化生产节约了生产成本，另一方面，生防菌B048的活菌数为4.63× 109cuf／m L，远高于目前市场上同类的微生物菌剂的活菌数含量2.0×108cuf／mL［13］。

本试验只是在摇床条件下对发酵培养基的组成及其培养条件进行了优化，而拮抗菌制剂的生防作用的发挥与制备工艺、使用方法和菌剂使用时温度、湿度、p H值等环境因素密切相关，所以，在拮抗菌制剂商业化过程中，一方面要继续加大对拮抗菌活性物质发酵工艺、提取与纯化方法等的研究，另一方面加大拮抗菌制剂发挥最佳作用条件的研究，今后尚需在发酵罐中和田间实验里进行验证，在实际生产中对发酵条件的控制方面也尚需进一步研究；其次，本实验中对最佳碳源、氮源、无机盐离子和正交实验法优化培养基配比研究，仅仅以液体发酵液中的活菌数含量作为指标，并没有其他的与之相对应的筛选模型作为依据，例如，对峙法、牛津杯法、离体植物组织平皿法、活体植株筛选法等［14］，因此，可能会对实验结果造成一定的误差，在以后的实验中，可以设计类似的实验方案，如测定大豆疫霉拮抗细菌B048对大豆疫霉的抑菌圈大小，来进一步验证实验的准确性和完整性；最后，在今后的研究中，可以对该拮抗菌株B048的活性物质进行研究，利用活性物质分离纯化技术，确定其活性物质的组成、性质和合成途径，也可以进一步研究基因遗传工程等手段，提高拮抗菌的活性及抑菌谱，这些可能为提高发酵滤液中活性成分含量的关键条件。

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Screening of Liquid Medium and Optimization of Fermentation Conditions for a Bacterium B048 against Phytophthora Sojae

WANG Wan， ZHAO Ping－sheng， ZHOU Tao， WANG Zi－ying
（Departmentoflifescience，HefeiNormalUniversity，Hefei230061，China）

Single factor test and orthogonal chart were used to optimize the fermentation medium of a bacterium B048.The results indicated that the medium was corn flour 5 g／L，soybean meal 15 g／L，sodium chloride 10 g／L.On the basis of the medium components，the culture conditions were optimized.The results show that the initial pH value is 6，the incubation time is 48 h，and the rotational speed is 180 r／min.

Phytophthorasojae；B048；culture medium；fermentation

Q939.96

A

1674－2273（2011）06－0079－04

2011－06－20

国家自然科学基金项目（30800040）；安徽省优秀青年科技基金项目（10040606Y04）；教育部留学回国人员科研启动基金项目

汪莞（1990－），女，安徽合肥人，合肥师范学院生命科学系08生物科学专业学生；通讯联系人：王子迎（1976－），安徽灵璧县人，教授，博士，研究方向：真菌病害控制。