枯草芽孢杆菌产弹性蛋白酶对肉嫩化的工艺研究

韩建春，邢明伟

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150040）

枯草芽孢杆菌产弹性蛋白酶对肉嫩化的工艺研究

韩建春1，邢明伟2

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150040）

从前期研究枯草芽孢杆菌胞外分泌物中获得弹性蛋白酶，将之应用到猪肉背最长肌和牛主动脉，通过弹性蛋白酶溶液浸泡，采用嫩度计和电镜观察，发现此弹性蛋白酶作用于猪肉和主动脉，50℃，50min，添加量为4%，可以提高猪肉的嫩度。弹性蛋白酶的添加使牛主动脉的组织纹理打破，出现断裂和孔隙，可以使牛主动脉的韧度下降。

弹性蛋白酶，嫩度，剪切力

肉的嫩度是消费者重视的食用品质之一［1］。为了获得较好的嫩度，肉类工业中常采取一些嫩化技术。目前，国内外主要利用木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和菠萝蛋白酶的降解作用，进行畜肉类的嫩化［2］。其中，木瓜蛋白酶的效果最好，但是它不能水解未处理过的弹性蛋白［3］。弹性蛋白酶主要作用于中性非芳香族氨基酸残基的羧基端肽键。因此，弹性蛋白酶对弹性蛋白表现出很高的水解特性［4］。另外，由于弹性蛋白酶可优先水解肉类中坚韧的弹性纤维部分，真正起到使肉类嫩化又不会改变口味和风味的作用，而不是单纯地对食用蛋白加以非选择性部分消化。由于弹性蛋白酶能够高度专一水解结缔组织中的胶原和硬蛋白，不破坏其它成分，从而达到肉类嫩化而不失其口味的目的，弹性蛋白酶的嫩化作用明显优于目前普遍使用的肉类嫩化剂［5］。因此可以作为理想的肉类嫩化剂用于食品加工业。另外，弹性蛋白酶除了在食品工业中有重要的应用外，它还广泛地应用于医药业、日用化学以及制革业等，有着极高的应用价值［6］。弹性蛋白酶既可以由动物胰脏提取，也可以由微生物发酵制得。目前，国内外仍主要利用动物胰脏生产弹性蛋白酶，原料来源和中间环节限制了弹性蛋白酶的产量，并导致其价格昂贵。利用微生物生产弹性蛋白酶不仅能够大量生产，降低弹性蛋白酶的生产成本，而且能为弹性蛋白酶的广泛应用提供方便。但是现在分离得到的产酶菌株都不同程度的存在着一定的毒性，对人体存在着潜在的危害，而且筛选到的菌株产酶水平较低，酶活性低，稳定性较差［7-10］。本研究以一株无致病性的枯草芽孢杆菌为产酶菌株，获得弹性蛋白酶，通过电镜观察酶添加对弹性蛋白的影响，以此为弹性蛋白酶的实际应用进行探索研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌 购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌种编号10071；猪肉 哈尔滨市香坊区中央红超市；牛主动脉 哈尔滨市南岗区早市；弹性蛋白酶 为本研究提纯获得；干酪素、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏 北京奥博星生物技术有限责任公司；β-环糊精 上海山浦化工有限公司；硼砂-硼酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液；试剂 均为分析纯。

pHS-3C型pH计 上海精密仪器科学有限公司；手提式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；SW-CJ-1D型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司；HZQ-X100振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；牛津杯、电子天平、分析天平、离心机、水浴锅、嫩度计、扫描电镜。

1.2 实验方法

1.2.1 弹性蛋白酶水解能力的测定方法 取猪背最长肌切10cm×3cm×1cm条块，牛主动脉4cm长，放在含有弹性蛋白酶的溶液中浸泡，对照组采用同样的方式。

1.2.2 肉嫩度的测定方法 取肉样，在室温条件下置于剪切仪上测定剪切肉样所需的剪切力值，以N为单位表示，数值越小，肉越嫩。测三次计算平均值。

1.2.3 扫描电镜观察的方法 取用弹性蛋白酶粗提液浸泡处理过的主动脉，顺着纹理切成2mm×3mm的长方形小块，在固定液中固定1.5h左右后取出。将固定好的主动脉用pH为6.8的缓冲溶液冲洗三次，每次10min。将用缓冲液处理后的主动脉分别用50%、70%、90%的乙醇脱水，每次10～15min；然后用100%的乙醇脱水三次，每次10～15min。乙醇脱水结束后将主动脉先用乙醇∶叔丁醇=1∶1的溶液浸泡15min，再用叔丁醇浸泡15min。将用叔丁醇浸泡处理过的主动脉冻干4h后喷金上膜，即可进行电镜观察。

1.2.4 不同温度下弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用取弹性蛋白酶，在50、60、70℃条件下分别与猪肉、主动脉作用，1h后测定肉的嫩度，同时用扫描电镜观察主动脉的纹理，以不添加弹性蛋白酶的猪肉、主动脉作为空白样，测定不同温度下，弹性蛋白酶对猪肉及主动脉的嫩化情况。

1.2.5 不同时间弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用 在50℃条件下，将弹性蛋白酶分别作用于猪肉、主动脉，每隔10min测定一次肉的嫩度，同时观察主动脉的纹理变化，测定弹性蛋白酶对猪肉及主动脉的嫩化情况。

1.2.6 不同添加量时弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用将添加量为1%、2%、3%、4%、5%、6%的弹性蛋白酶分别作用于猪肉及主动脉，待弹性蛋白酶与猪肉、主动脉作用1h后，测定猪肉的嫩度，同时用扫描电镜对主动脉进行观察，测定不同添加量的弹性蛋白酶对猪肉及主动脉的作用情况。

2 结果与讨论

2.1 不同温度下弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用

由图1看到，在50℃条件下，酶对肉的嫩化度为5.43%，60℃时嫩化度为5.36%，70℃时的嫩化度为3.64%，由此可见，在50℃条件下，弹性蛋白酶对猪肉的嫩化效果最好。弹性蛋白酶的活性较高。伴随着温度的升高，存在着酶活性降低、肌肉蛋白质变性和收缩的问题，导致肉的剪切力增加、嫩度减小。

由图2～图4电镜照片可以直观地看出牛主动脉纹理的变化情况。总的来说，未经过酶处理的主动脉纹理都比较清晰，经过酶处理以后，纹理变的杂乱，并出现断裂。尤以50℃处理后，牛主动脉的断裂更加明显，进一步说明50℃是弹性蛋白酶的最适温度。伴随着温度的提升，对于主动脉的水解有一定的促进作用，而酶添加后，水解的发生比未添加酶明显。

图1 不同温度弹性蛋白酶处理60min对肉类的嫩化作用

图2 50℃条件下A（不加酶）与B（加酶）牛主动脉的1700倍电镜照片

图3 60℃条件下A（不加酶）与B（加酶）牛主动脉的1700倍电镜照片

图4 70℃条件下A（不加酶）与B（加酶）主动脉的1700倍电镜照片

2.2 不同酶解时间对肉类的嫩化作用

由图5可以看出，随着时间的变化，酶对猪肉的嫩化效果更加明显，在50min后，嫩化的速度降低。图6电镜照片显示的是在不同时间，主动脉纹理的宏观变化情况。由照片可以看出，主动脉的纹理越来越不清晰，变得杂乱，说明酶破坏了主动脉的肌束，使得主动脉得到嫩化。开始时主动脉的条理分明，但是随着与酶作用时间的延长，条纹先是出现不再整齐的排列现象，而后空隙变大；接着出现断裂及纹理的位移，如图6-D、6-E、6-F，这种纹理的变化随着主动脉与酶作用时间的延长而越发明显，说明弹性蛋白酶对弹性蛋白的作用随着时间的变化而加强。但是超过50min，嫩化的速度降低，可能与酶的活性降低有关。

图5 不同时间弹性蛋白酶对肉类的嫩化作用

图6 50℃条件下加酶处理的牛主动脉不同时间后500倍电镜照片

2.3 不同添加量对于肉类的嫩化作用

如图7可见，固定作用温度50℃，时间50min，我们发现不同的酶添加量对于猪肉的嫩化效果也不相同。添加酶组分随着酶添加量的增加，肌肉的剪切力逐渐降低，综合考虑生产成本、加工程序等因素，初步认为4%的添加量可以实现肉嫩度的提高。由图8我们看到，随着弹性蛋白酶添加剂量的增加，牛主动脉的纹理变得杂乱，出现裂隙和孔洞，说明了弹性蛋白酶作用导致主动脉壁的弹性蛋白分解，组织解体，坚韧度下降，嫩度提高。

3 结论

实验研究得到的弹性蛋白酶应用于对猪肉及主动脉的嫩化，在50℃条件下，4%左右添加量的弹性蛋白酶与猪肉及主动脉作用50min，嫩化的效果较好。

图7 不同添加量的酶对肉的嫩化情况

图8 50℃条件下加酶处理的牛主动脉不同蛋白酶添加量的1700倍电镜照片

［1］孔保华，马丽珍.肉品科学与技术［M］.第一版.北京：中国轻工业出版，2003：216.

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［4］杨星勇.球孢白僵菌凝乳弹性蛋白酶（BbPr1）的纯化与特性［J］.菌物系统，2000，19（2）：254-260.

［5］张娟，刘书亮.弹性蛋白酶在肉类工业中的应用［J］.肉类研究，2007，98（4）：19-21.

［6］王娟丽，王以强，李奠础，等.微生物生产弹性蛋白酶现状研究［J］.山西化工，2005，25（4）：34-36.

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［9］孙秀华，张昌莲.从一例外伤病人的创面分离一株芳香黄杆菌.中国社区医师（综合版），2006（12）：68-72.

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Study on application of extracellular elastase by Bacillus.Subtilis in meat

HAN Jian-chun1，XING Ming-wei2
（1.College of Food Science，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；2.College of Wildlife Source，Northeast Forest University，Harbin 150040，China）

The elastase can tender the porcine longissimus dorsi muscle and the borvine aorta by adding the extracellular elastase from Bacillus.Stubtilis.By the muscle tenderness meter and electron microscopic observation，the condition of 50℃，4%addition elastase and reaction 50min had best tenderization result to pork.The ligament of borvine aorta was broken by the addition of elastase.

elastase；tender；shearing force

TS201.3

A

1002-0306（2011）02-0166-04

2010-02-26

韩建春（1973-），男，博士，副教授，研究方向：畜产品加工。

黑龙江省科技厅攻关项目（GA07B401-3）。