三维荧光二阶校正法快速测定环境水体和淤泥样中麦穗宁残留量*

聂重重 吴海龙 卿湘东 李元娜 李 勇 许 慧 朱绍华 俞汝勤

(湖南大学化学化工学院，化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙 410082)

三维荧光二阶校正法快速测定环境水体和淤泥样中麦穗宁残留量*

聂重重 吴海龙＊＊卿湘东 李元娜 李 勇 许 慧 朱绍华 俞汝勤

(湖南大学化学化工学院，化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙 410082)

将激发发射荧光光谱与化学计量学基于交替三线性分解(ATLD)算法的二阶校正方法相结合，实现了自来水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥5种实际复杂体系中麦穗宁含量的直接快速定量测定.当选取组分数为2时，用ATLD算法分辨获得的平均回收率分别为(100.5±1.3)%、(93.8±1.1)%、(95.0±2.1)%、(98.2 ±2.3)% 和(91.3 ±1.6)%，检测下限(LOD)分别为 0.58、1.38、4.47、5.60、0.43 pg·mL－1.另外，还用椭圆置信区间(EJCR)测试，品质因子如灵敏度(SEN)、选择性(SEL)和定量检测限(LOQ)评估了方法的准确性.实验结果表明，该方法能够实现未知荧光背景干扰共存下麦穗宁含量的直接快速定量测定.

麦穗宁，三维荧光，二阶校正，交替三线性分解，化学计量学.

长期以来，由于人们在防治农作物病虫害过程中不合理和超剂量使用化学农药，导致农药残留量越来越高，影响了人类身体健康，也破坏了农业生态环境［1］.苯并咪唑类杀菌剂是20世纪60年代末、70年代初开发的一类含有苯并咪唑分子结构的高效、广谱内吸性杀菌剂，主要有多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、麦穗宁、甲基托布津等.麦穗宁(Fuberidazole，简称FBZ)，是农业生产中最重要的苯并咪唑类杀菌剂［1］，广泛用于收获前或收获后防治水果、蔬菜和观赏植物上的各种病虫害，也可以直接用于土壤或撒向农田，其残效期较长，因而麦穗宁残留在农产品和环境中比较普遍，对人类身体健康和生态环境都有影响，因此对环境中麦穗宁进行监测非常必要.

目前用于测定麦穗宁的方法有液相色谱－荧光检测法(LC－Fluorescence)［2－5］、流动注射分析荧光检测法(FIA－Fluorescence)［6］、连续注射分析可变角扫描荧光法(SIA－VASF)［7］、基于光电传感器的荧光光谱法［8］等.其中液相色谱法预处理复杂，仪器昂贵且使用大量的有毒溶剂;流动注射分析荧光检测法在处理实际背景时需要复杂的预富集过程;荧光光谱法仪器费用低，灵敏度高，但选择性差.由于麦穗宁的荧光光谱与复杂样品背景的光谱严重重叠，因而未经分离直接用光谱的方法检测环境水体和淤泥中的麦穗宁几乎是不可能的.若引入化学计量学方法，以“数学分离”代替化学及物理分离，提高荧光光谱法的选择性从而实现较低检测下限，则能实现复杂体系目标成分的直接快速测定.

本文提出了一种激发发射荧光与二阶校正方法相结合检测实际环境体系中麦穗宁的方法.采用基于交替三线性分解(ATLD)［9］算法的二阶校正方法与三维荧光光谱相结合，对环境水体和淤泥样中的麦穗宁含量进行了直接定量测定，方法简单快速、绿色，且具有即使有未知干扰共存也不影响其感兴趣成分定量分析结果的优点.

1 方法原理与实验部分

1.1 三线性成分模型

将K个样本在选取激发波长数为I、发射波长数为J条件下进行测定，得到的激发发射荧光光谱矩阵可构成三维响应数阵X(I×J×K)，它满足下面这个三线性成分模型:其中N表示对体系有实际贡献的荧光成分数;xijk是三维响应数阵中的元素，它表示第k个样本在激发波长为i、发射波长为j时的荧光强度;ckn是相对浓度阵C(K×N)中的元素;ain是相对激发光谱阵A(I×N)中的元素;bjn是相对发射光谱阵 B(J×N)中的元素;eijk是三维残差数阵(I×J×K)中的元素.

1.2 交替三线性分解算法［9］(ATLD)

通过利用交替最小二乘原理，借助基于切尾奇异值分解(TSVD)的Moore－Penrose广义逆计算和交替迭代步骤来改进三线性分解的性能，使损失函数即残差阵元素的平方总和达到极小化.该算法可同时获得关于三维数阵的相对激发光谱阵A，相对发射光谱阵B以及相对浓度阵C.对A、B、C作适当处理后，再根据文献［9］的二阶校正步骤作未知样中目标组分的直接定量分析.

1.3 品质因子

分析品质因子，例如灵敏度(SEN)、选择性(SEL)和检测下限(LOD)，通常用来验证预测结果的准确性.在二阶校正中，分析品质因子的估计跟纯分析信号的计算密切相关，SEN是指单位浓度的纯分析信号，而SEL是指灵敏度和总信号的比值.本文根据文献［10］所报道的公式来计算SEN和SEL:

其中，下标nn代表矩阵的第(n，n)个元素;k为组分n在单位浓度时的总信号，它也是浓度得分参数.根据下式［11－12］估计检测下限(LOD):

其中，s(0)为3个背景空白样本的预测浓度偏差.定量检测限(LOQ)由下式来计算:

1.4 主要仪器与试剂

日立F－4500型荧光分光光度计(日本日立公司)，用1 cm石英比色皿进行激发－发射三维荧光扫描;KQ－250TDB型高频数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，TGL－16A型高速冷冻离心机(德国Sigma公司);手提式压力蒸汽灭菌器;得到的所有光谱数据使用Matlab软件处理，ATLD程序和校正过程用到的线性回归程序均为实验室自编.

麦穗宁(FBZ)标准品(湖南出入境检验检疫局提供，500.94 μg·mL－1)，无水乙醇、磷酸、磷酸二氢钠(均为分析纯)购自裕丰(中国长沙).自来水(湖南大学化学化工学院)，湘江水(湖南长沙湘江)，池塘水(取自湖南大学逸夫楼旁一池塘)，雨水(湖南长沙岳麓区)，淤泥样品(采于湖南长沙湘江边).实验所有用水均为二次水.

1.5 实验方法

用乙醇配制 5.0 μg·mL－1的储备液.实验时，取适量储备液用二次水定容，配制5.0 ng·mL－1的工作液.用磷酸二氢钠、磷酸配制成pH值为2.0的磷酸盐缓冲溶液，根据文献［6］，麦穗宁在pH 2.0时荧光强度最大，所以本实验选取pH 2.0的磷酸盐缓冲溶液.所有溶液均存放于4℃冰箱中.

湘江水、池塘水、自来水、雨水通过离心除去其中的颗粒悬浮物，过滤，高温灭菌备用.取淤泥若干，于锥形瓶中用甲醇超声萃取30 min，然后再离心15 min(7000 r·min－1)，过滤，滤液用旋转蒸发器旋干，收集浓缩液高温灭菌备用.

校正样的配制(1—10):在10个10 mL容量瓶中分别加入不同体积的麦穗宁工作液和2 mL磷酸盐缓冲溶液，用二次水定容，保持麦穗宁的浓度在0—250.5 pg·mL－1范围内(在此范围内，麦穗宁的荧光信号强度与其浓度呈正比关系).

验证样的配制(11—18):8个验证样的配制方法与校正样类似，麦穗宁的浓度在校正样的浓度范围之内.

实际样的配制:平行配制自来水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥5组30个实际样，在每组6个10 mL容量瓶中分别加入不同体积的麦穗宁工作液(浓度见表1)和2 mL磷酸盐缓冲溶液，再分别加入自来水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥提取液作为基质干扰，用二次水定容.实际样的浓度在校正样的浓度范围内.

为了避免瑞利散射峰的影响，本文选取激发波长范围为264—340 nm，间隔2 nm取一个数据;发射波长范围为 326—425 nm，间隔 3 nm取一个数据;狭缝宽度为 5.0/5.0 nm;扫描速度为1200 nm·min－1.在对样本进行三维荧光光谱扫描过程中，分别在扫描前、中、后测定3个缓冲液空白样本，通过扣除空白样本的平均值，可以尽可能地减少溶剂引起的拉曼散射、瑞利散射和衍射的影响.另外，5种高温灭菌液各平行测定3次作为背景空白样本，用于计算背景预测浓度的标准偏差s(0).

2 结果与讨论

2.1 验证样分析

采用ATLD算法对校正样和验证样(1—18)进行解析.算法解析得到验证样的(11—18)预测浓度与真实的添加浓度非常接近，麦穗宁的平均回收率为(101.3±1.7)%，线性相关系数为0.9994.对于人工合成样，ATLD给出了满意的结果，但是本文所用方法具有的“二阶优势”没有充分体现.为充分体现其优势，在下面实验中尝试在环境水体和淤泥中测定麦穗宁的含量.

2.2 环境水体和淤泥样中FBZ激发发射光谱

在对环境水体和淤泥样中麦穗宁进行浓度预测之前，首先利用核一致诊断法(CORCONDIA)［13］对所得到的三维数阵(湘江水样)进行秩估计，得到结果如图1所示.前二个因子所对应的核一致值为1.0，当选择因子数为3时，核一致值小于0.6，因此该三维阵的化学秩为2，即2个因子.在选择的三维荧光扫描范围内，待分析物麦穗宁都有很强的荧光，因此可知FBZ为该三维模型贡献了1个组分;另外1个组分是由背景干扰物质贡献给模型的.同理，其余背景成分数也均为2.

图1 利用核一致法预估计三维数据阵的秩(湘江水)Fig.1 Estimating the rank of a three－way data array by using CORCONDIA method(river water)

用ATLD算法分辨得到的自来水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥中FBZ的相对激发光谱和发射光谱图见图2.可以明显看出实际体系中待分析物FBZ的激发发射光谱与内源物质即基体的光谱严重重叠，但用ATLD算法分辨得到的激发发射光谱与真实光谱非常吻合，且对于不同的实际样，算法每次分辨出的背景基体的激发光谱和发射光谱完全不一致，但分辨出的FBZ的激发和发射荧光光谱却基本上没有变化，都与纯的FBZ光谱几乎完全吻合，说明经ATLD算法分辨得到的FBZ激发和发射光谱在不同背景中是一致的、可靠的，验证了三线性分解的唯一性及本方法的可靠性.另外从分辨得到的相对光谱数据可知，FBZ的最大激发和发射波长分别为314 nm和353 nm.

2.3 环境水体和淤泥样中FBZ的测定及回收率

从分辨得到的光谱图可知，环境水体和淤泥样中的待测组分FBZ的荧光光谱与内源物质背景光谱严重重叠，给FBZ的直接定量测定带来系统误差.因此，仅用一般荧光分析方法不经过化学分离就直接对样品进行定量分析几乎是不可能的，而具有“二阶优势”的化学计量学方法与三维荧光分析相结合，用“数学分离”代替繁琐的化学或物理分离，则可以很好地在未知干扰共存下对目标成分进行定量分析.

图2 5种实际复杂体系中FBZ的真实光谱和用ATLD算法分辨得到的激发光谱和发射光谱(N=2)(－ － － － － －真实的;——分辨得到的;……分辨得到的背景;a1、b1自来水样;a2、b2湘江水样;a3、b3池塘水样;a4、b4雨水样;a5、b5淤泥样)Fig.2 Actual and mathematically resolved excitation and emission spectra of FBZ using ATLD in five complicated samples when the component number was chosen as two

按实验方法测定环境水体和淤泥样中的FBZ，用激发发射荧光扫描获得的三维响应数阵采用基于ATLD的二阶校正方法进行解析，预测浓度结果和平均回收率见表1.对于自来水、湘江水、池塘水、雨水和淤泥实际样，用 ATLD 算法分析所得的相关系数分别为 0.9984、0.9987、0.9980、0.9975 和 0.9985，平均回收率分别为(100.5 ±1.3)%、(93.8 ±1.1)%、(95.0 ±2.1)%、(98.2 ±2.3)%和(91.3 ±1.6)%.由数据可以看出，该方法可实现环境水体和淤泥中FBZ的直接快速定量测定，为环境质量的管理与改善提供了科学依据.

表1 用ATLD算法分辨得到的环境水体和淤泥样中FBZ的浓度(N=2)Table 1 Determination of FBZ in aquatic and river sediment samples using ATLD algorithm(N=2)

预测残差均方根 (RMSEP)［14］:

其中，I为预测样本数，Cact和Cpred为待测物的真实浓度和预测浓度.

2.4 品质因子和椭圆置信区间

本文用几种品质因子，如灵敏度(SEN)、选择性(SEL)、检测限(LOD)和定量检测限(LOQ)评估了所用方法的准确性，其结果见表2.与常用方法相比［1－7］，可以看出本方法的检测限较低:0.43—5.60 pg·mL－1.为了进一步调查所用方法的准确性，对实际浓度与预测浓度进行了线性回归分析［15］，接着基于椭圆置信区间(EJCR)测试［16］，将计算得到的截距和斜率与理想值0和1进行了比较，图3绘出了ATLD算法的椭圆置信区间.从图3中可以看出，对于5种实际样，理想点(0，1)都在ATLD算法得到的椭圆内，说明该算法可以用于实际复杂体系中目标组分的直接快速选择性定量分析，并可获得满意的结果.

图3 用ATLD算法得到的椭圆置信区间Fig.3 Elliptical joint confidence region of the ATLD algorithm

表2 品质因子Table 2 Figures of merit

3 结论

本文用激发发射矩阵荧光光谱与化学计量学二阶校正方法，相结合测定了环境水体和淤泥样中麦穗宁的残留量.该方法以水作溶剂，利用化学计量学二阶校正方法，在背景干扰共存下对环境水体和淤泥样中目标组分进行直接快速定量测定.在环境水体和淤泥样中采用ATLD算法分辨获得的平均回收率在91.3%—100.5%之间，相对标准偏差在1.1%—2.3%之间，且检测限与其它方法相比较低，为0.43—5.60 pg·mL－1.实验证明，该方法能够解决实际体系中待分析物光谱与内源荧光物质光谱严重重叠所引起的难分辨问题，可以在未知背景干扰共存下对待测组分进行直接、快速、定量分析，并获得了满意的结果，且方法简单、快速、绿色环保，在环境检测、食品安全等领域将是一种很有潜力的分析方法.

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RAPID DETERMINATION OF FUBERIDAZOLE IN AQUATIC ENVIRONMENTAL AND RIVER SEDIMENT SAMPLES USING THREE-DIMENSIONAL FLUORESCENCE COUPLED WITH SECOND-ORDER CALIBRATION METHOD

NIE Chongchong WU Hailong QING Xiangdong LI Yuanna LI Yong XU Hui ZHU Shaohua YU Ruqin
(State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha，410082，China)

Fuberidazole(FBZ)is one of the most important benzimidazole fungicides used in the field of agriculture.It persists in the environment after usage for a long time，which is a risk to human health and the environment.Therefore，it is important to quantify FBZ in the presence of complicated matrix background.A novel method has been proposed for the rapid determination of FBZ in environmental samples using three－dimensional fluorescence coupled with the second－order calibration method based on the alternating trilinear decomposition(ATLD)algorithm.When their component numbers were set to 2，the obtained average recoveries of FBZ in tap water，river water，pond water，rain water and river sediment samples were(100.5 ± 1.3)%、(93.8 ±1.1)%、(95.0 ±2.1)%、(98.2 ±2.3)%and(91.3 ±1.6)%，respectively.The limit of detection(LOD)was 0.58、1.38、4.47、5.60、0.43 pg·mL－1，respectively.Furthermore，the accuracy of the method was also evaluated through the elliptical joint confidence region(EJCR)tests as well as the figures of merit，such as sensitivity(SEN)，selectivity(SEL)and limit of quantification(LOQ).It showed that the proposed method could be used to directly determine fuberidazole contents even in the presence of unknown interferents and would provide a method for monitoring FBZ in the environment.

fuberidazole，three－dimensional fluorescence，second－order calibration，alternating trilinear decomposition，chemometrics.

2011年1月7日收稿.

*国家自然科学基金(20775025);国家科技部973预研项目(2007CB216404);国家教育部长江学者和创新团队发展计划项目资助.＊＊通讯联系人，E－mail:hlwu@hnu.edu.cn