高效液相色谱法优化盐地碱蓬甜菜红素提取工艺研究

高 雪，王 倩，李 珂，吴蕊蕊，王宝山，*，李国强

(1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014; 2.中国海洋大学医药学院，山东青岛266000)

高效液相色谱法优化盐地碱蓬甜菜红素提取工艺研究

高 雪1，王 倩1，李 珂1，吴蕊蕊1，王宝山1，*，李国强2，*

(1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014; 2.中国海洋大学医药学院，山东青岛266000)

以黄河三角洲潮间带盐地碱蓬地上部分为实验材料，采用高效液相色谱法，通过测定实现基线分离的甜菜红素类成分在特征吸收波长550nm下的峰面积，对甜菜红素的提取工艺进行了优化。结果表明，在室温下，以60%乙醇为提取溶剂，料液比1∶20，超声浸提30min，浸提2次，可最大效率地提取盐地碱蓬中的甜菜红素类成分。

高效液相色谱，盐地碱蓬，甜菜红素，提取工艺

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫红色表型盐地碱蓬 以生长在黄河三角洲潮间带的紫红色表型盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)的地上部分洗净烘干，粉碎机粉碎，-20℃保存备用;乙醇分析纯，烟台三和化学试剂有限公司;甲醇 分析纯，色谱纯，天津广成化学试剂有限公司;水 娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈有限公司;ODS填料 50μm，北京绿百草科技发展有限公司。

表2 盐地碱蓬中甜菜红素的HPLC数据

Agilent 1100高效液相色谱仪 G1379A脱气机，G1311A四元泵，G1313A自动进样仪，G1316A柱温箱，G1315A DAD二极管阵列检测器，HPLC化学工作站;色谱柱 Agilent Zorbax XDB C18柱(4.6mm× 250mm，5μm);Agilent 1100 LC/MSD TOF液质联用仪 美国;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型制造厂;旋转蒸发仪 Heidolph，德国;KQ-250B型超声仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 流动相:A为0.1%甲酸水，B为甲醇，梯度洗脱:B相(体积%)，0～30min(20～30);流速:1.0mL·min-1;检测波长:550nm;进样量:20μL;柱温:25℃。

1.2.2 提取溶剂选择 称取1g盐地碱蓬粉末5份，分别加入水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇各50mL，超声提取30min。抽滤，滤液低温(40℃)浓缩至一定体积，用ODS小柱纯化。以pH3.0的甲酸水溶液洗脱除盐，95%甲醇-甲酸水洗脱，洗脱液低温(40℃)蒸干，残渣用0.5mL水溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，进样分析，记录色谱图，计算峰面积。

1.2.3 提取方式的选择 称取1g盐地碱蓬粉末3份，分别加入60%乙醇，以室温冷浸、超声及热回流三种浸提方式提取30min。抽滤，滤液低温(40℃)浓缩至一定体积，用ODS小柱纯化。以pH3.0的甲酸水溶液洗脱除盐，95%甲醇-甲酸水洗脱，洗脱液低温(40℃)蒸干，残渣用0.5mL水溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，进样分析，记录色谱图，计算峰面积。

1.2.4 正交设计 以提取次数A、提取时间B和料液比C三个因素作为考察盐地碱蓬甜菜红素提取工艺的主要影响因素，采用L9(33)正交表进行实验。

表1 正交实验因素水平

2 结果与讨论

2.1 提取物组成分析

为了对甜菜红素类成分组成进行分析，实验首先通过色谱条件优化，建立了能够使甜菜红素类成分个峰达到基线分离的色谱条件，如1.2.1所述。在该色谱条件下，盐地碱蓬提取物的化学成分得到了较好分离(图1)。其中，峰1～4的最大吸收在546nm左右，质谱碎片中均含有甜菜红素类成分母核碎片离子(质荷比388)，证明峰1～4均属于甜菜红素类成分［8］。峰1～4占总峰面积的84.89%，表明甜菜红素类成分为提取物中的主成分(见表2)。

图1 盐地碱蓬甜菜红素的液相色谱图

2.2 提取溶剂选择

以峰1～4总峰面积为评价依据，由图2可知，提取溶剂为水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇的甜菜红素峰面积均没有明显差异，而80%乙醇浸提的甜菜红素峰面积显著降低，一定量的乙醇能降低某些酶的活性。从纯化、提取效率等综合考虑，选取60%乙醇作为实验的提取溶剂。

图2 浸提剂对甜菜红素提取效率的影响注:数据为3个重复的平均值±SE，*表示差异显著(p＜0.05)，图3同。

2.3 提取方式选择

选用60%乙醇作为提取试剂，分别用冷浸、超声和热回流三种方式提取，以峰1～4总峰面积为计算依据，结果如图3。三种提取方式均没有显著差异，热回流提取方式温度较高，样品易降解，对甜菜红素的稳定性有一定影响。超声提取操作简单，提取效果更为理想，因此实验确定选用超声的方式进行提取。

2.4 提取工艺优化

采用60%乙醇超声提取，对影响甜菜红素提取的主要工艺参数提取次数、提取时间、料液比进行了三因素三水平正交实验优化。因素水平设计见表1，结果见表3。

由表3中极差R值大小可知，各因素作用主次A＞C＞B，即浸提次数＞料液比＞浸提时间。分析各因素不同水平的甜菜红素提取率(以峰1～4总峰面积计)，A2与A3、B因素三个水平及C2与C3的均值差异不大。考虑到工业应用成本因素，甜菜红素的最佳提取工艺选择为A2B1C2，即室温下，用60%乙醇以1∶20料液比超声浸提30min，浸提2次。正交实验4号的峰1～4总峰面积为21001，在9次实验中峰面积最大，与优化工艺参数一致，也进一步证实了所建立的优化甜菜红素提取工艺的可靠性。

图3 提取方式对甜菜红素提取效率的影响

表3 正交实验结果

3 结论

紫红色表型盐地碱蓬是广泛分布于滨海湿地或部分涝洼积水地带的一年生草本耐盐植物，生物量大，其中的无毒天然红色素是合理开发利用盐生植物资源的可行途径之一。甜菜红素类成分极性较大，酸、碱、光、热稳定性差，分离与结构鉴定难度较大。本研究参照文献［9-10］，选择ODS固相萃取小柱pH3.0的酸水洗脱盐，通过色谱条件优化，首次建立了所有色谱峰均达到基线分离的HPLC色谱分析条件。并运用LC-MS连用技术，通过各色谱峰质谱裂解碎片所提供的结构信息，结合各色谱峰的紫外及可见光的最大吸收特征光谱，指认了盐地碱蓬提取物中的甜菜红素类成分。所建立的HPLC分析方法对于准确评价甜菜红素提取工艺具有重要价值。

到目前为止，未见定量研究盐地碱蓬中甜菜红素提取工艺的报道。实验以甜菜红素类成分的总峰面积为相对定量评价标准，通过正交设计，建立了高效提取盐地碱蓬中甜菜红素的制备工艺:室温，60%乙醇，1∶20料液比，超声浸提30min，浸提2次。在优化的提取条件下，提取物中甜菜红素相对含量达到85.24%。研究结果具有较好的应用开发前景。

［1］岳晓翔，陈敏，段迪，等.绿色和紫红色表型盐地碱蓬叶片抗氧化系统比较研究［J］.山东师范大学学报:自然科学版，2008，23(1):121-124.

［2］ Wang CQ，Zhao JQ，Chen M，et al.Identification of betacyanin and effects of environmental factors on its accumulation in halophyte Suaeda salsa［J］.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2006，32(2):195-201.

［3］Strack D，ThomasVogt，Willibald Schliemann.Recent advances in betalain research［J］.Phytochemistry，2003，62: 247-269.

［4］Steglich W，Strack D.Betalains［J］.In the Alkaloids: Chemistry and Pharmacology，1990:1-62.

［5］ Clement JS，Mabry TJ.Pigment evolution in the Caryophyllales:A systematic overview［J］.Botanica Acta，1996，109:360-367.

［6］吴涛，姚志刚，许杰，等.盐地碱蓬红色素的提取工艺及稳定性研究［J］.食品科学，2009，30(10):97-100.

［7］段迪.盐地碱蓬甜菜红素提取分离及纯化工艺的研究［D］.山东师范大学生命科学学院，2009.

［8］Jerz G，Skotzki T，Fiege K，et al.Separation of betalains from berries of Phytolacca americana by ion pair high-speed countercurrent chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2008，1190:63-73.

［9］Cai YZ，Sun M，Corke H.HPLC characterization of betalains from plants in the Amaranthaceae［J］.Journal of Chromatographic Science，2005，43:454-460.

［10］Stintzing F C，Schieber A，Carle R.Identification of betalains from yellow beet(Beta vulgaris L.)and cactus pear［Opuntia ficus -indica(L.)Mill.］by high-performance liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry［J］.Journalof Agricultural and Food Chemistry，2002，50:2302-2307.

Optimization of extraction technology of betacyanins from Suaeda salsa L.by high performance liquid chromatography

GAO Xue1，WANG Qian1，LI Ke1，WU Rui-rui1，WANG Bao-shan1，*，LI Guo-qiang2，*
(1.College of Life Sciences，Shandong Normal University，Jinan 250014，China; 2.School of Medicine and Pharmacy，Ocean University of China，Qingdao 266000，China)

The aerial part of Suaeda salsa L.growing in the intertidal area of Yellow River Delta were used to optimize the extraction technology of betacyanins.The optimum extraction conditions of that 60%ethanol solution was used as extraction solvent，ratio of material to solvent was 1∶20 and extraction was achieved with ultrasonic twice at room temperature in 30min，were established by determining the total peak areas of four betacyanin components in high performance liquid chromatography.

high performance liquid chromatography;Suaeda salsa L.;betacyanin;extraction technology

TS201.1

B

1002-0306(2011)03-0259-04

盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)，别名黄须菜、盐吸、碱葱，属藜科(Chenopodiaceae)碱蓬属(Suaeda)一年生草本植物，是一种肉质化真盐生植物，能在盐碱化土壤和滨海滩涂地区正常完成生活史［1］。自然条件下盐地碱蓬主要有两种表型:在滨海的潮间带或部分涝洼积水地带生长的植株，在整个生长期地上部分皆为紫红色;而在地势较高或距离海边较远的盐碱地植株则呈现绿色。王长泉等已经初步确定其红色素为甜菜素类的甜菜红素［2］。甜菜素是一种水溶性含氮色素，包括甜菜红素(betacyanin)和甜菜黄素(betaxanthin)2种类型［3］。到目前为止，人们发现石竹目13个科的植物中除粟米草科和石竹科积累花色素外，其他各科植物都积累甜菜素，部分高等真菌中也发现产甜菜素［4-5］。甜菜红素作为天然食用色素，不仅安全无毒，而且营养价值较高，对人体有诸多医疗保健作用，是广泛使用的纯天然色素之一。为了合理开发利用盐生植物资源，已有学者对盐地碱蓬甜菜素的提取工艺进行过研究。吴涛等［6］利用分光光度法，研究了盐地碱蓬红色素的提取工艺以及光、热、pH、氧化还原剂、糖、金属离子等对色素稳定性的影响。本实验室前期也采用紫外分光光度法较系统地研究了浸提溶剂、浸提时间、浸提温度、料液比、浸提次数等因素对盐地碱蓬红色素提取的影响［7］。分光光度法是基于化学成分的最大吸收波长与物质的量的线性关系的一种定量分析方法，虽然操作简单，但选择性较低。因而本文利用高效液相色谱法，通过测定实现基线分离的甜菜素类成分在特征吸收波长550nm下的总峰面积，运用正交设计，对盐地碱蓬甜菜红素的提取工艺进行了研究。所使用的研究方法选择性强，结论准确，研究结果对于耐盐植物盐地碱蓬资源甜菜红素的组成分析及合理开发利用具有重要的借鉴价值。

2010-07-28 *通讯联系人

高雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向:植物生理与分子生物学。

国家自然科学基金(30870138);科技部高新计划项目(863)资助(2007AA091701)。