芒果核提取物的抑菌活性组分分析

李春美，田 燕，钟慧臻，杨 立，周丽明

(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070)

芒果核提取物的抑菌活性组分分析

李春美，田 燕，钟慧臻，杨 立，周丽明

(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070)

对芒果核乙醇提取物采用AB-8大孔树脂和SephadexLH-20柱进行初步纯化得到不同级分。抑菌实验表明，芒果核多酚在一定的浓度下对供试的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和金黄葡萄球菌都有较强的抑菌活性，随着浓度的升高，抑菌效果也明显升高，但是对供试的两种真菌均无明显抑菌活性;不同级分芒果核多酚的抑菌活性不同，芒果核多酚经SephadexLH-20柱分离所得的组分III是芒果核多酚的主要抑菌活性组分，结合HPLC-ESI-MS的分析，表明芒果核多酚的抑菌活性组分主要为含有不同取代度的没食子酰基葡萄糖类物质。

芒果核，多酚，抑菌，活性组分

1 材料与方法

1.1 实验材料

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、啤酒酵母(Saccharmoyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger) 由本院微生物教研室提供;供试培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、琼脂1.5%)，马铃薯蔗糖琼脂培养基(马铃薯20%、葡萄糖1.8%、琼脂1.8%);芒果核购自华中农业大学市场;对照品茶多酚 购自四川筠连茶多酚厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 以60%乙醇水溶液为提取溶剂，提取时间60min，料液比1∶10，水浴温度60℃回流制得的芒果核多酚粗提物，经AB-8树脂纯化后制得多酚初步纯化物，将此初步纯化物上SephadexLH-20柱后，20%乙醇洗脱得多酚组分Ⅰ，40%乙醇洗脱得组分Ⅱ，60%乙醇洗脱得组分Ⅲ。称取一定量真空冷冻干燥的样品，在超净工作台上用无菌水溶解样品至所需的浓度，备用。对照品茶多酚，淡黄棕色粉末，EGCG含量大于85%。

表1 芒果核多酚的抑菌作用

1.2.2 菌悬液的制备 将供试菌株于斜面培养基上活化，用接种环挑取1～2环于50mL无菌生理盐水三角瓶中振荡10min(内有数粒玻璃珠)，要求菌悬液约108CFU/mL左右备用。

1.2.3 含菌平板制作 新鲜配制的培养基于121℃条件下灭菌，当培养基冷却至50～60℃时，于超净工作台上将培养基倒入灭菌的ø90mm的培养皿中，每皿15～20mL培养基，待平板冷却后，每皿中加入0.5mL菌悬液，用三角玻璃涂棒均匀涂成薄板备用。

1.2.4 抑菌效果的测定

1.2.4.1 滤纸圆片法检测抑菌效果［6］将无菌滤纸片浸入配好的药液中12h，沥干。每一含菌平板上，呈正三角形排布3片带药无菌纸片，细菌于37℃条件下培养24h，啤酒酵母和黑曲霉于30℃条件下培养5d，测其抑菌圈直径。根据抑菌圈大小来确定其抑菌效果。

1.2.4.2 平板计数法检测抑菌效果 将芒果核多酚配成浓度为0.5、1、2、3、4mg/mL的溶液，移取0.5mL的各浓度的芒果核多酚溶液于灭菌平板中，再滴入0.2mL的菌悬液，倾入15mL融化的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，让它们充分混匀，待含菌培养基凝固后倒置培养24h后计菌落数。以不加芒果核多酚溶液为对照。

1.2.5 HPLC分析条件 YWG C18色谱柱(4.6mm× 250mm，10μm)，柱温:30℃;流动相:A相:水-乙酸(98∶2);B相:乙腈-0.5%乙酸(50∶50)，洗脱梯度: B相:20%-45%-55%-20%;时间(min):0-35-55-60;进样量:10μL;流速:0.25mL/min;检测波长:280nm。

1.2.6 HPLC-ESI-MS分析条件 液相条件:Zorbax SB-C18色谱柱(2.1×150mm，5μm);柱温:30℃;流动相:A相:水-乙酸(98∶2);B相:乙腈-0.5%乙酸(50∶50);进样量:1μL;流速:0.25mL/min;洗脱梯度: B相:20%-45%-55%-20%;时间(min):0-35-55-60;检测波长:280nm。

质谱条件:电喷雾(ESI)离子化源;质量扫描范围:100～2000;干燥气流速:8L/min;干燥气温度: 350℃;喷雾器压力:30psi。

2 结果与分析

2.1 芒果多酚抑菌活性的研究

2.1.1 滤纸片法检测芒果多酚的抑菌作用 由表1可以看出，当浓度为8mg/mL时，芒果核多酚粗提物对所试四种细菌均具有较强的抑制作用，经AB-8大孔树脂初步纯化后，其对供试的几种细菌的抑菌活性有所增强;且随着浓度的升高，抑菌效果也明显升高，当浓度增至8mg/mL与同浓度的茶多酚相当。但是对供试的两种真菌均无抑制活性。

2.1.2 平板计数法检测芒果核多酚初步纯化物的抑菌效果 由表2可知，随着芒果核多酚浓度的增加，芒果多酚的抑菌活性增强，当芒果核多酚浓度增加到2mg/mL时，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌完全不生长;当芒果多酚浓度增加到3mg/mL时，大肠杆菌和金黄葡萄球菌完全不生长。平板计数法与滤纸片法相比抑菌效果更加明显，这可能与芒果多酚在滤纸片上的吸附和扩散能力有关。

表2 不同浓度芒果核多酚初步纯化物对细菌作用后的菌落数(cfu/mL)

2.1.3 滤纸片法检测不同级分芒果多酚的抑菌作用

由表3可以看出，用60%乙醇水溶液洗脱后得到的组分Ⅲ在2mg/mL的浓度下对供试的几种细菌都有较强的抑菌活性，与同浓度的茶多酚抑菌效果相当，但对供试的两种真菌均无抑菌活性，而采用20%和40%乙醇水溶液洗脱后所得组分Ⅰ和组分Ⅱ对供试的几种微生物均无抑菌活性。

表3 不同级分芒果核多酚提取纯化物的抑菌作用

2.2 芒果核多酚各级分的高效液相色谱分析

抑菌实验表明，芒果核多酚组分Ⅲ为主要的活性级分，为进一步弄清其抑菌活性组分的结构，将上述所得的芒果核多酚组分Ⅲ进行HPLC分析，结果如图1所示。

由图1可知，所得组分Ⅲ在HPLC上的分离效果不尽理想，为此，将组分Ⅲ重新上Sephadex LH-20柱，采用60%乙醇洗脱并进行分部收集，此级分可得到两个洗脱峰(组分Ⅲ-A和组分Ⅲ-B)，其HPLC分析图分别见图2及图3。从这两个图可以看出，组分Ⅲ-A主要含保留时间分别为19.3、32.1、41.2min的三个峰，而组分Ⅲ-B的主要成分为保留时间34.3min的化合物。

图1 芒果多酚组分Ⅲ的高效液相色谱图

图2 组分Ⅲ-A的高效液相色谱图

图3 组分Ⅲ-B的高效液相色谱图

2.3 芒果多酚各级分的HPLC-MS分析

2.3.1 组分Ⅲ-A的HPLC-MS分析 图4～图6分别是组分Ⅲ-A的HPLC、总离子流图及主要峰的MS及MS2碎片离子图。此级分主要含有保留时间分别为2.0、4.7、9.1及12.4min的四个峰，其中峰1的［M-H］-的m/z为635，由于没有更多的碎片信息，依据其HPLC保留特性和分子离子峰，经与相关文献［7］对比，此化合物可能为三没食子酰基葡萄糖。峰2～峰4的［M-H］-的m/z均为197，由于未能得到更多结构信息，这些化合物的结构尚不能确定。

图4 组分Ⅲ-A的高效液相色谱图

图5 组分Ⅲ-A的总离子流图

图6 图4中峰1～峰4的ESI-MS图谱

2.3.2 组分Ⅲ-B的HPLC-MS分析 图7～图9分别是组分Ⅲ-B的HPLC、总离子流图及主要峰的MS碎片离子图。此级分主要含有保留时间分别为9.0、13.8、15.0、15.3、16.7、21.7及23.6min的7个峰，其中前5个峰［M-H］-的m/z均为787，结合其分子量信息、HPLC保留特性和文献［7］报道的芒果核多酚的特性和结构分析，初步判断此5个峰均为四没食子酰基葡萄糖。峰6和峰7其［M-H］-的m/z分别为470和579，由于未能得到更多结构信息，两个化合物的结构尚不能确定。

图7 组分Ⅲ-B的高效液相色谱图

图8 组分Ⅲ-B的总离子流图

3 结论

芒果核多酚在一定的浓度下对供试的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和金黄葡萄球菌都有较强的抑菌活性，随着浓度的升高，抑菌效果也明显升高，当其浓度达到3mg/mL时，可以完全抑制四种供试细菌的生长，但是对供试的两种真菌均无明显抑菌活性。芒果核多酚经AB-8大孔树脂和SephadexLH-20柱进行初步纯化后所得的组分Ⅲ对供试菌的抑制活性最强，与茶多酚相当，是芒果主要的抑菌活性组分。HPLC-ESI-MS的分析结果初步表明，芒果多酚的抑菌活性组分主要含有不同取代度的没食子酰基葡萄糖类物质，有关其它化合物的结构还有待更进一步研究。

图9 图7中峰1～峰7的ESI-MS图谱

［1］Andreas S，Wieland U，Reinhold C.Characterization of polyphenols in mango puree concentrate by HPLC with diode array and mass spectrometric detection［J］.Innovative Food Science＆Emerging Technologies，2000(1):161-166.

［2］徐志，吴莉宇.芒果皮萃取物在抗食品病源微生物中的应用［J］.华南热带农业大学学报，2002，8(4):11-13.

［3］覃丽俭，王强，吴莉宇.芒果皮萃取物抑菌成分稳定性探讨［J］.广西农业科学，2007，38(4):423-426.

［4］李琳，姜新发，张志斌，等.枇杷皮和芒果皮粗提液抗氧化活性研究［J］.电子科技大学学报，2003，32(6):755-759.

［5］Toshihide K，Hadjime N，Megumi A，et al.Characterization of novel antimicrobial compounds from mango(Mangifera indica L.) kernel seeds［J］.Food Chemistry，2000，71:61-66.

［6］董金甫，李瑶卿.茶多酚抑菌作用的研究［J］.生物学杂志，1992(4):19-22.

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Study on the antibacterial active constituents of mango kernel polyphenol

LI Chun-mei，TIAN Yan，ZHONG Hui-zhen，YANG Li，ZHOU Li-ming
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

The antibacterial activities of polyphenol extracts from mango kernel and the activity fraction were studied.The results showed that polyphenol extracts from mango kernel had inhibitory effects on 4 kinds of tested bacteria(Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Bacillus thruingiensis)，but had no effect on yeast and Aspergillus niger.The inhibitory effect of fraction III purified from the crude extract by AB-8 macroporous resin and sephadexLH-20 columns was the strongest on the tested bacteria.HPLC-ESI-MS analysis showed that the main active antibacterial constituents of mango kernel polyphenol were indican compounds of gallotannins such as tri-O-galloyl-glucose and tetra-O-galloyl-glucose.

mango kernel;polyphenol;antibacterial activity;active fraction

TS255.1

A

1002-0306(2011)03-0172-04

芒果(Mangifera indica Linnaeus)属漆树科芒果属(Mangifera Linn.)常绿乔木，是热带亚热带著名水果，我国芒果产地主要分布在海南、广东、广西、福建、云南、四川和台湾等省(区)。在加工过程中占芒果总重20%～40%左右的果皮和果核一般都被丢弃或用作饲料，而果皮和果核等副产物中含有大量的可被利用的多酚类化合物。目前国内外对于芒果多酚的研究非常有限，国外Andreas等［1］对芒果肉多酚组成进行了研究，徐志等［2］和覃丽俭等［3］对芒果皮粗提物的微生物抑制活性进行了初步研究，李琳等［4］研究了芒果皮粗提液的抗氧化活性。对芒果核多酚的研究，仅Toshihide等［5］对芒果核粗提物的抗食品病源微生物的性质进行了研究，初步分析表明具有病源微生物抑制活性的成分是多酚物质。本文对芒果核多酚的抑菌活性及抑菌活性组分进行了研究，旨在变废为宝，为充分利用我国的芒果资源，开发新型抑菌剂提供理论依据。

2010-03-01

李春美(1973-)，女，博士，副教授，研究方向:天然产物化学。