副干酪乳杆菌副干酪亚种L1的培养条件及絮凝活性研究

张莉力，许云贺，李新华

(1.辽宁医学院，辽宁锦州121001; 2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161)

副干酪乳杆菌副干酪亚种L1的培养条件及絮凝活性研究

张莉力1，2，许云贺1，2，李新华2，*

(1.辽宁医学院，辽宁锦州121001; 2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161)

酸浆是我国传统的鲜薯(或绿豆)淀粉生产工艺中用于淀粉分离净化的生物絮凝剂。本实验对从自然发酵的甘薯酸浆中分离的、对甘薯淀粉具有高絮凝活性的副干酪乳杆菌副干酪亚种L1的培养条件和絮凝活性进行了研究。结果表明，副干酪乳杆菌副干酪亚种L1为兼性厌氧菌，在改良TJA培养基初始pH为7.0，在25℃培养48～60h时，菌体的生长状况和絮凝活性最好;Na+、K+对L1的絮凝活性有显著的增强作用，但对高温和胰蛋白酶敏感。

副干酪乳杆菌副干酪亚种，甘薯淀粉，微生物絮凝剂

1 材料与方法

1.1 材料与设备

副干酪乳杆菌副干酪亚种 L1(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei L1) 由本实验室从自然发酵甘薯酸浆中分离获得;改良TJA培养基 番茄汁50mL、酵母粉5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氢二钾2g、吐温80 1g、醋酸钠5g，pH6.8±0.2，蒸馏水1000mL，121℃灭菌30min。

高压灭菌锅 BKF1-HJK型，北京中西远大科技有限公司;厌氧培养箱 YOX-I型，上海跃进医疗器械厂;电子分析天平 M4-AL204，兰州中西仪器;恒温培养箱 DHP-9082型，金坛市鑫鑫实验仪器厂;水浴锅 DK-98-1型，天津泰斯特仪器公司;超净工作台 JB-VS-1300型，苏州佳宝净化工程设备有限公司;pH测定计 DHP-9052型，上海一恒科技有限公司;数码生物显微镜 ME21，OLYMPUS。

1.2 实验方法

1.2.1 生长曲线的测定 将 L.paracasei subsp. paracasei L1接种至改良TJA培养基中活化48h，再以5%的接种量接种于装有400mL改良TJA液体培养基的三角瓶中，混合均匀后分别取10mL混合液放入40支无菌试管中，30℃培养，分别培养0、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、38、40、42、44、48、60、72h，测定550nm处的吸光度。以培养时间为横坐标，相应吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.2 絮凝活性的测定 实验用絮凝率来定量表示乳酸菌对甘薯淀粉乳的絮凝性［3］。具体方法如下:在100mL量杯中加入5g甘薯淀粉，加水至100mL，摇匀，静置2min。加入5mL混匀的乳酸菌培养液，混合、搅拌，静置沉降3min，在上清液面下10mL处取样。用紫外可见分光光度计测定其上清液吸光度，波长选用550nm，同时，以空白培养基代替上清液作对照实验，并用以下公式计算其絮凝率:

其中:A-空白上清液的吸光度;B-样品上清液的吸光度。

1.2.3 温度对L1生长及絮凝活性的影响 将副干酪乳杆菌副干酪亚种L1接入改良TJA液体培养基中，分别在20、25、30、35、40、45℃下培养2d，测定发酵液的OD值及絮凝活性。

1.2.4 培养基初始pH对L1生长及絮凝活性的影响

用0.1mol/L的HCl和NaOH分别调节改良TJA液体培养基的pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接入菌种，30℃下培养2d，测定发酵液的 OD值及絮凝活性。

1.2.5 通气量对L1生长的影响 将副干酪乳杆菌副干酪亚种L1接入改良TJA液体培养基中，分别将其放在生化培养箱静置培养、恒温振荡培养箱在90r/min下振荡培养和厌氧培养箱内厌氧培养，30℃下培养2d，测定发酵液的OD值。

1.2.6 阳离子对L1絮凝活性的影响 配制1%浓度的各盐溶液:KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2、KAl(SO4)2、Al2(SO4)3、Fe2(SO4)3、FeSO4、ZnSO4，然后分别取各盐溶液1mL与发酵液一同加入到100mL的甘薯淀粉悬浊液中做絮凝性实验，计算各菌体浓度下的絮凝率。

1.2.7 加热温度对L1絮凝活性的影响 将副干酪乳杆菌 L1的发酵液分别在30、40、50、60、70、80、90℃水浴中加热30min，然后分别测定加热后的发酵液对甘薯淀粉悬浊液的絮凝率。

1.2.8 酶处理对L1絮凝活性的影响 用250mmol/L EDTA及蒸馏水各洗两次菌体，洗过的菌体细胞重新悬于分别加有蛋白酶、糖化酶的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，30℃保温，在不同时间取样，测定絮凝水平。

2 结果与分析

2.1 生长曲线

从图1菌株L1的生长曲线可以看出，在接种0～4h为延滞期，4～28h为对数生长期，28～60h为稳定期，之后为衰亡期。

图1 副干酪乳杆菌副干酪亚种L1的生长曲线

2.2 培养温度对副干酪乳杆菌副干酪亚种L1生长及絮凝活性的影响

分别在20、25、30、35、40、45℃温度下培养L1 48h，然后测定发酵液的吸光度和絮凝活性，结果见图2。由图2可以看出，副干酪乳杆菌副干酪亚种L1在25～35℃范围内均可正常生长，最适生长温度为25～30℃，且在此温度下絮凝活性最高，在45℃下几乎不生长，也无絮凝活性。

图2 培养温度对副干酪乳杆菌L1生长及其絮凝活性的影响

2.3 培养基初始pH对副干酪乳杆菌副干酪亚种L1生长及絮凝活性的影响

培养基初始pH对乳酸菌L1生长及絮凝活性的影响见图3。从图3可以看出，副干酪乳杆菌副干酪亚种L1适应较宽的pH范围，pH6～8条件下生长均较好，絮凝率也较高，pH7.0时菌体生长状况最好，絮凝活性最高。

图3 pH对副干酪乳杆菌L1生长及絮凝活性的影响

2.4 通气量对副干酪乳杆菌副干酪亚种L1生长的影响

分别将三角瓶放置在静置、恒温振荡培养箱和厌氧培养箱中进行培养，观察通气情况对菌株絮凝活性的影响。由图4可以看出，虽然O2通入条件不同，L1菌株均能生长，其中以振荡方式进行培养的三角瓶中氧气通入最高，其菌体密度最高、生长状况最好;厌氧培养的三角瓶中的菌体密度最低。说明L1菌株属于兼性厌氧菌，有O2或没O2存在的情况下L1菌株均可生长，有O2时生长状况更好些。

图4 不同培养方式对L1生长的影响

2.5 不同阳离子对副干酪乳杆菌副干酪亚种L1絮凝活性的影响

由于微生物菌体表面的结构及电性的不同，不同的离子，或同种离子存在的化合物形式不同，都会不同程度地影响微生物的絮凝活性［4-6］，因为淀粉悬浊液带负电性，所以选用以下一些阳离子进行絮凝实验。按照胶体理论，阳离子可以和水中带负电性胶体微粒的表面电荷结合，使其克服胶体颗粒间的静电排斥力，从而可以使胶体颗粒脱稳并形成细小的凝聚体。这些凝聚体再与微生物絮凝剂反应形成大絮团，然后快速下沉。

图5为不同阳离子对L1絮凝活性的影响，Na+、K+等阳离子对L1的絮凝活性均有增强作用，Ca2+、Mg2+、Fe2+对絮凝也有不同程度的促进作用，而Fe3+对絮凝有抑制作用，其余阳离子影响很小，所以，可选Na+作为助凝剂。

图5 阳离子对L1絮凝活性的影响

2.6 加热温度对副干酪乳杆菌副干酪亚种L1絮凝活性的影响

将发酵液在30、40、50和60℃的水浴中加热30min，然后测定发酵液的絮凝活性，结果见图6。从图6中可以看出，温度对副干酪乳杆菌L1的絮凝活性影响很大，在30℃时，发酵液的絮凝活性还在87.03%，40℃时就降为76.52%，而当温度在50℃以上时，发酵液就基本不具有絮凝活性。从发酵液对温度敏感性可以判断出，菌体上的絮凝因子不具有热稳定性，絮凝活性受温度影响较大，所以絮凝因子的化学成分不是多糖类物质，因为多糖类物质的结构不会因高温而改变，絮凝因子的化学成分有可能是对温度敏感的蛋白类物质，因为蛋白质在高温时容易变性，破坏其原有结果，从而使其絮凝活性丧失。这一结果也进一步说明该絮凝因子存在于菌体细胞上。

2.7 酶处理对副干酪乳杆菌L1絮凝活性的影响

图6 加热温度对副干酪乳杆菌L1絮凝活性的影响

不同酶对副干酪乳杆菌L1絮凝活性的影响如图7。在胰蛋白酶催化水解作用下，絮凝活性物质的絮凝水平迅速下降，在20min时，絮凝活性降低到低于10%。因此，该絮凝活性物质对胰蛋白酶的作用是敏感的，在胰蛋白酶的作用下其絮凝活性显著下降，这是因为絮凝活性物质在酶的作用下水解，从而引起多聚物分子质量降低所致，证明菌体表面的絮凝因子的化学成分主要是蛋白质。从图7中也可以看出，α-淀粉酶对副干酪乳杆菌的絮凝活性也有影响，但是影响较小，这也说明菌体表面的絮凝因子的化学成分除了蛋白质之外还含有多糖类物质。

图7 酶对副干酪乳杆菌L1絮凝活性的影响

3 结论

本研究对从自然发酵的甘薯酸浆中分离到的对甘薯淀粉具有高絮凝活性的副干酪乳杆菌副干酪亚种L1的培养条件及絮凝活性进行了研究，得到以下结论:

L1在30℃改良TJA培养基上，经过4h，L1进入生长的对数期，28h达到稳定期，60h进入衰亡期;在改良TJA培养基初始pH为7.0，振荡培养条件下，在25℃培养48～60h时，L1菌体的生长状况和絮凝活性最好;不同的阳离子、温度及酶对L1的絮凝活性均有影响:Na+、K+对L1的絮凝活性有增强作用，Ca2+、Mg2+、Fe2+对絮凝也有不同程度的促进作用，而Fe3+对絮凝有抑制作用，Al3+、Zn2+影响很小;温度对副干酪乳杆菌L1的絮凝活性影响很大，当温度在50℃以上时，发酵液就基本不具有絮凝活性;L1菌株对胰蛋白酶的作用是敏感的，在胰蛋白酶的作用下其絮凝活性显著下降，α-淀粉酶对副干酪乳杆菌的絮凝活性也有影响，但是影响较小，这说明菌体表面的絮凝因子的化学成分主要为蛋白质，除此之外也含有多糖类物质。

［1］北京粉丝厂，北京大学生物系酸浆研究小组.酸浆为什么能沉淀淀粉［J］.北京大学学报，1974(1):57-63.

［2］张莉力，许云贺，李新华.甘薯酸浆中微生物絮凝性研究［J］.食品工业科技，2010(7).

［3］罗平.RL-2生物絮凝剂的研制及絮凝机理研究［D］.重庆大学，2005.

［4］程金平，张兰英，张玉玲.微生物絮凝剂的絮凝性能研究［J］.吉林大学学报:地球科学版，2002，32(4):413.

［5］Salehizadeh H，Shojaosadati S A.Extracellular biopolymeric flocculants recent trends and biotechnological importance［J］. Biotechnology Advances，2001，19:371-385.

［6］Jelena Lozo，Branko Jovcic，Milan Kojic.Characterization of a Novel Bacteriocin and an Unusually Large Aggregation Factor of Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BGSJ2-8，a Natural Isolate from Homemade Cheese［J］.Curr Microbiol，2007，55: 266-271.

Culture condition and flocculating activity of Lactobacillus paracasei subsp.paracasei L1

ZHANG Li-li1，2，XU Yun-he1，2，LI Xin-hua2，*
(1.Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China; 2.Food Science College of Shenyang Agriculture University，Shenyang 110161，China)

Sweet potato acid steeping liquor was a bioflocculant of separation and purification in sweet potato starch production.It was studied that the culture condition and flocculating activity of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei L1 isolated from natural fermentation of sweet potato acid steeping liquor.Lactobacillus paracasei subsp.paracasei L1 was facultative aerobe.The optimal growth condition was regarded as follows:the optimum temperature and initial pH was 25℃ and 7.0，and cultured for 48～60h.Na+and K+could promote the flocculant formation and the flocculation of L1 was sensitive to high temperature(50℃)and trypsin.

Lactobacillus paracasei subsp.paracasei;sweet potato starch;microbialflocculant

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0139-04

酸浆法生产淀粉是我国劳动人民的一项独特的创造，一直流传到今天。把甘薯淀粉乳放置一些时候，经过自然发酵，形成一种具有微酸味的乳白色或黄白色液体，就制成了沉淀淀粉用的“酸浆”。“酸浆”在淀粉生产过程中主要起到促进淀粉与蛋白质等其他杂质的分离，并净化淀粉的作用［1］。研究表明酸浆中起作用的主要因素不是酸，也不是其它物质，而是酸浆中存在的微生物菌体本身［1-2］。本文对从自然发酵的甘薯酸浆中分离出的对淀粉具有高絮凝活性的副干酪乳杆菌副干酪亚种L1的生长特性及絮凝活性进行了研究，旨在为酸浆发酵剂的制备和生产中絮凝条件的控制提供理论依据。

2010-04-02 *通讯联系人

张莉力(1977-)，女，博士在读，讲师，主要从事食品微生物方向的研究。

辽宁省教育厅资助项目(2008431)。