黑莓果渣不同溶剂提取物抗氧化活性研究

李 立，刘晔玮，李红兵，李 丽，赵剑喜，邸多隆

(1.兰州大学公共卫生学院，营养与食品卫生研究所，甘肃兰州730000; 2.中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室，甘肃兰州730000; 3.中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州730000)

黑莓果渣不同溶剂提取物抗氧化活性研究

李 立1，2，3，刘晔玮1，*，李红兵1，2，3，李 丽1，2，3，赵剑喜1，2，3，邸多隆2，3，*

(1.兰州大学公共卫生学院，营养与食品卫生研究所，甘肃兰州730000; 2.中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室，甘肃兰州730000; 3.中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州730000)

黑莓果渣经不同溶剂(水、pH3水、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯)在室温下振摇提取，得到黑莓果渣不同溶剂提取物。分别采用总抗氧化能力测定体系、DPPH·(1，1-二苯基-2-苦基肼)自由基体系、羟基自由基体系、超氧阴离子自由基体系，对黑莓果渣不同溶剂提取物总抗氧化能力、清除DPPH·、O-2·和·OH的活性进行测定，并与VC进行比较。结果表明，黑莓果渣不同溶剂提取物均有不同程度抗氧化能力;酸性溶剂提取效果优于非酸性溶剂;60%乙醇为最佳的提取溶剂，其提取物总抗氧化能力、清除DPPH·和O-2·活性均弱于VC，而清除·OH活性较强且高于VC。

黑莓，抗氧化，自由基，提取物

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑莓 南京新得力食品有限公司提供，低温避光保存，临用前取出，放至室温;总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒 购自南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)标准品、VC标准品 购自Sigma公司;双重蒸馏水 实验室自制;其它试剂 均为分析纯。

CH-8606微量分析天平 Mettler-Toledo公司; SHA-B多功能恒温振荡器 江苏正基仪器有限公司;RE-52CS-2旋转蒸发器 巩义市予华仪器有限公司;T6新世纪紫外-紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑莓果渣不同溶剂提取物的制备 取黑莓榨汁后残渣，干燥，过38目筛去籽得黑莓果渣，分别精密称取适量的黑莓果渣粉末7份，按1g∶20mL比例加入不同提取溶剂(水、pH3水、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯)，在恒温振荡器上25℃振摇3h，过滤，得不同溶剂提取液。在旋转蒸发仪上减压浓缩至近干时，用少量溶剂转移到蒸发皿中，经真空干燥(40℃)得黑莓果渣不同溶剂提取物，低温避光保存，备用。

1.2.2 黑莓果渣总抗氧化能力的测定 黑莓果渣不同溶剂提取物总抗氧化能力通过南京新得力食品有限公司提供总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒测定。定义为在37℃时，每分钟每毫克浸膏使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。

其中:ODU:测定管吸光度值;ODC:对照管吸光度值;N:反应体系稀释倍数(反应体系总体积/取样量);C:待测溶液浓度(mg/mL)。

1.2.3 黑莓果渣清除DPPH·活性的测定［7-8］DPPH·标准液的制备:用甲醇配制浓度为 0.052mg/mL的DPPH·标准品溶液。临用时将储备液稀释至0.026mg/mL的工作溶液。

精密称取适量黑莓果渣不同溶剂提取物，用乙醇溶解(超声助溶)，根据其活性强弱将其稀释至一定浓度，分别取1、2、4、6、8mL，用95%乙醇稀释至10mL。分别移取上述不同浓度的样品溶液2mL，加入2mL上述DPPH·标准溶液，使总体积为4mL，即为样品反应溶液。精密量取乙醇2mL，加入DPPH·溶液2mL，使总体积为4mL，即为空样溶液。精密量取2mL样品溶液，加入2mL甲醇，使总体积为4mL，即为空白溶液。分别将样品溶液、空样溶液和空白溶液混匀后，在室温避光反应30min后，在517nm波长处测定吸光值，得到A样品、A空样和A空白。按式(2)计算样品对DPPH·自由基清除率。

1.2.4 黑莓果渣清除·OH活性的测定［9-10］精密称取适量的黑莓果渣不同溶剂提取物和VC标准品，分别配制成一定浓度的溶液。首先向反应试管中依次加入0.5mL 5.0mmol/L邻二氮菲溶液、2mL磷酸盐缓冲溶液(pH7.40)，充分混匀后，加入1mL 2.5mmol/L FeSO4水溶液后混匀，然后加入0.5mL 0.1%的双氧水溶液，加水稀释至5mL。于37℃恒温水浴中反应60min后，在536nm测其吸光度作为损伤管，记为AS。同上操作，不加双氧水溶液测吸光值作为未损伤管，记为AW。加入1mL样品后再加双氧水操作作为样品管，测吸光度为AY。按式(3)计算样品对·OH的清除率:

式中:ΔA和ΔA0分别表示加入样品和水后的邻苯三酚自氧化速率，即每分钟吸光度的平均变化率。

2 结果与分析

2.1 浸膏得率和总抗氧化能力

黑莓果渣不同溶剂提取物浸膏得率及总抗氧化能力见表1。由表1可知，pH3水提物浸膏得率最高，达到了48%以上;水、60%乙醇和80%乙醇提取物浸膏得率次之，为43%左右;正丁醇与乙酸乙酯提取物浸膏得率最低。由表1可知，黑莓果渣不同溶剂提取物中，60%乙醇提取物总的抗氧化能力最强，达到9.67个单位。黑莓果渣不同溶剂提取物总抗氧化能力强弱顺序为:60%乙醇提取物＞80%乙醇提取物＞pH3水提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

表1 不同溶剂提取物浸膏得率、总抗氧化能力及综合指标

2.2 清除DPPH·活性

黑莓果渣不同溶剂提取物清除DPPH·活性见图1。由图1可以看出，各提取物浓度与其清除率之间存在一定的量效关系。黑莓果渣不同溶剂提取物清除DPPH·活性均低于VC，黑莓果渣不同溶剂提取物中60%乙醇提取物清除DPPH自由基活性最强，IC50达到0.045mg/mL左右。各溶剂提取物清除DPPH·活性强弱顺序为:VC＞60%乙醇提取物＞pH3水提取物＞80%乙醇提取物＞水提取物＞95%乙醇提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

图1 不同溶剂提取物清除DPPH·活性

2.3 清除·OH活性

黑莓果渣不同溶剂提取物清除·OH活性见图2。在0.25～1.25mg/mL浓度范围内，60%乙醇、80%乙醇和 pH3水提物清除活性均强于 VC，在浓度1.25mg/mL时60%乙醇提取物清除率达到100%。同时可以看出，在0.25～1.25mg/mL浓度范围内，pH3水提物的清除率要高于单纯水提取物，这说明pH3水提物活性要高于水提物。对不同溶剂提取物清除·OH活性强弱总的排序为:60%乙醇提取物＞80%乙醇提取物＞pH3水提取物＞95%乙醇提取物＞VC＞水提取物。

图2 不同溶剂提取物清除·OH活性

2.4 清除O-2·活性

黑莓果渣不同溶剂提取物清除O2-·活性见图3。由图3可知，各提取物清除活性强弱依次为:VC＞60%乙醇提取物＞pH3水提取物＞水提取物＞95%乙醇提取物＞80%乙醇提取物。黑莓果渣不同溶剂提取物清除O2-·活性要明显弱于VC;pH3水提取物清除活性要强于水提取物活性。

图3 不同溶剂提取物清除物O-2·活性

2.5 加权法评价

通过加权法综合总抗氧化能力和浸膏得率来筛选最佳的提取黑莓果渣中抗氧化活性物质的溶剂。由于总抗氧化能力是反映提取物抗氧化效果主要的指标，故将总抗氧化能力权重设定为0.6;浸膏得率也是反映提取效果的一个重要方面，将其权重设定为0.4。按式(5)计算不同溶剂提取效果的综合指标，结果见表1。

综合指标=(浸膏得率/浸膏得率最大值×0.4+总抗氧化能力/总抗氧化能力最大值×0.6)×100%式(5)

3 结论

3.1 由于乙酸乙酯和正丁醇提取物在反应液中很难溶解，故在清除·OH和O2-·活性测定中剔除。根据实验和分析，结果表明，黑莓果渣不同溶剂提取物均具有不同程度的总抗氧化能力和清除DPPH·、·OH、O2-·活性;60%乙醇提取物总抗氧化能力和自由基清除活性均为各测定提取物中最强，其清除·OH活性较好，且高于VC;但其总抗氧化能力、清除DPPH·活性和清除O2-·活性均要低于同等浓度的VC，推测一方面由于粗提取物中有效活性物质的含量大大低于纯的VC标准品，同时提取物中存在的大量多糖和果胶成分也抑制了活性的发挥［11］。

3.2 比较pH3水提物与水提物清除自由基活性和总抗氧化能力发现，提取溶剂酸碱值为影响黑莓果渣提取效果的因素，酸性溶剂提取效果较佳，这主要是由于VC和花色苷成分在碱性、中性环境容易破坏，而在酸性条件下稳定性较好［12-13］。

3.3 通过加权法综合总抗氧化能力和浸膏得率筛选出60%乙醇为最佳的黑莓果渣抗氧化物质提取溶剂。这与60%乙醇提取物清除DPPH·、·OH、·活性为所测提取物中活性最强的结果相一致。

［1］钱骅，张卫明，赵伯涛，等.黑莓果蔬汁加工工艺研究［J］.食品科技，2006(9):186-189.

［2］E Kafkas，M Kosar，N Turemis.Analysis of sugars，organic acids and vitamin C contents of blackberry genotypes from Turkey［J］.Food Chemistry，2006，97:732-736.

［3］Ingrid Elisia，Chun Hu，David G Popovich.Antioxidant assessment of an anthocyanin-enriched blackberry extract［J］. Food Chemistry，2007，101:1052-1058.

［4］焦中高，刘杰超，王思新.黑莓红色素抗氧化活性的研究［J］.食品科技，2003(8):63-65.

［5］陈欣欣，许时婴.从黑莓汁加工的废弃物中提取多酚类化合物［J］.食品工业科技，2006，26(12):135-139.

［6］陈欣欣，许时婴.黑莓渣提取物中多酚类化合物抗氧化活性的研究［J］.食品工业，2007(3):3-6.

［7］Nicole Cotelle，et al.Free Radical Bio and Med［J］，1998，20 (1):35-43.

［8］马庆一，张侠，熊卫东，等.红薯梗中清除自由基活性成分的研究［J］.食品科学，2003，24(6):145-148.

［9］金鸣，蔡亚欣，李金荣.邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/ Fe2+产生的羟自由基［J］.生物化学与生物物理进展，1996，23 (6):553-555.

［10］茹宗玲，李安林，张换平.月季花黄色素清除超氧自由基和羟自由基作用研究［J］.化学研究与应用，2009，21(9):1331 -1333.

［11］李云峰，郭长江，杨继军，等.石榴皮抗氧化物质提取及其体外抗氧化作用研究［J］.营养学报，2004，26(2):144-146.

［12］吴坤.营养与食品卫生学［M］.北京:人民卫生出版社，2003.

［13］G A F Hendry，J D Houghton.Natural food colorants［M］. London:Chapman＆Hall，1996:271.

Study on antioxidant activity of different solvents extracts from blackberry pomaces

LI Li1，2，3，LIU Ye-wei1，*，LI Hong-bing1，2，3，LI Li1，2，3，ZHAO Jian-xi1，2，3，DI Duo-long2，3，*
(1.Institute of Nutrition and Food Hygiene，College of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China; 2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China; 3.Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China)

The blackberry pomaces was vibrational extracted using different solvent including aqueous，aqueous (pH3)，60%ethanol，80%ethanol，95%ethanol，n-butanol and ethyl acetate in room temperature，respectively. And then the different extracts were obtained.The total antioxidant activity，the·OH antioxidant capacity，O-2· and DPPH· free radical scavenging capacity of the different extracts were determined spectrophotometrically using the total antioxidant capacity assay system，DPPH· system，hydroxyl radical system，superoxide radical system.The results showed that all the extracts from the blackberry pomaces had antioxidant activity and free radical scavenging activity.The acidic solvent had better effect than non-acidic solvent.The 60%ethanol was the appropriate solvent.And the total antioxidant capacity，scavenging capacity to O-2·and DPPH·of 60%ethanol extract were all weaker than VC，but the scavenging capacity to·OH was stronger than VC.

blackberry;antioxidant;radical;extract

TS255.1

A

1002-0306(2011)03-0116-04

黑莓(Blackberry)为蔷薇科悬钩子属植物，果汁主要用于制作甜点、果酱、果冻、果酒和饮料等［1］。在工业加工中会产生大量残渣，主要包含黑莓果渣和黑莓籽。工业上常将黑莓籽榨油，而将黑莓果渣废弃。研究表明，黑莓果渣中含有丰富的多酚类化合物和维生素，其提取物具有较好的抗氧化能力［2］，如将其作为抗氧化活性物质提取原料加以利用，可变废为宝，且资源丰富。Ingrid Elisia等对黑莓80%乙醇提取物中花色苷含量和抗氧化活性进行测定后发现，其花色苷成分可以抑制过氧化氢自由基对细胞内物质的氧化，并且花色苷含量与抗氧化能力存在很强相关性［3］。焦中高等对黑莓果实水提物还原能力、抗脂质过氧化和抑制邻苯三酚自氧化三个方面进行了抗氧化活性的测定，显示黑莓红色素可有效抑制亚油酸的过氧化和邻苯三酚自氧化［4］。在实验浓度范围内，其对亚油酸过氧化和邻苯三酚自氧化的最大抑制率分别可达98.70%和84.52%。陈欣欣等将榨汁后黑莓残渣按1∶10的料液比加入含有1%柠檬酸的不同浓度的乙醇溶液搅拌提取得到提取物，对其总多酚含量进行测定，结果证明，50%乙醇溶液提取物总酚含量最高［5-6］。本研究选用不同溶剂对黑莓果渣(去籽部分)进行提取，得到不同粗提物，通过对黑莓果渣不同溶剂提取物总的抗氧化能力(T-AOC)和清除DPPH·、·OH、O2-·活性的测定，来综合评价不同溶剂提取物抗氧化活性，并筛选出最佳的提取溶剂，为更好地利用黑莓果渣提供参考。

2010-02-05 *通讯联系人

李立(1984-)，男，硕士研究生，主要从事食品营养功效成分筛选研究。

甘肃省自然科学基金(096RJZA058);中国科学院“百人计划”择优项目。