一株生防菌LX-07的鉴定及其拮抗物的理化特性

王金爱，许文涛，，梁志宏，张雅楠，罗云波，黄昆仑，，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品安全检测与风险评估实验室，北京100083; 2.农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)，北京100083)

一株生防菌LX-07的鉴定及其拮抗物的理化特性

王金爱1，许文涛1，2，梁志宏2，张雅楠1，罗云波1，黄昆仑1，2，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品安全检测与风险评估实验室，北京100083; 2.农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)，北京100083)

LX-07菌株是从玉米根系土壤中分离筛选获得的一株具有抗真菌活性的细菌，通过菌落、菌体形态及16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。抑菌谱测定结果表明，该菌产生的拮抗物对常见植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用，表现广谱抗真菌活性。以链格孢霉作为指示菌，对拮抗物的理化特性进行了研究，结果表明:拮抗物在pH8.0下，在40～100℃范围内，抑菌活性不发生变化，121℃处理30min后抑菌活性略有下降，但仍为对照的90%以上;在室温下，pH2.0～12.0范围内拮抗物保持稳定，抑菌活性不受影响;拮抗物对胰蛋白酶不敏感，对胃蛋白酶、蛋白酶K敏感。

枯草芽孢杆菌，抗真菌，理化特性

1 材料与方法

1.1 实验材料

LX-07菌株 本实验室从玉米根系土壤中分离筛选到的拮抗细菌;用于抗真菌活性测定的靶标植物病原菌链格孢霉(Alternaria alternate)、疣孢青霉(Penicillum Ver uourlosum Peyrone)、赭 曲 霉(Aspergillus ochraceus)、绿色木霉(Trichoderma viride)由中国农业大学食品科学与营养工程学院微生物实验室分离鉴定和保存;油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、 小 麦 赤 霉 病 菌 (Fusarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Cotton-wilt Fusarium)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保存编号分别为36169、30941、36173;PDA、NA、NB培养基的配制 参照文献［6］，其中PDA培养基用于供试病原真菌的培养，NA、NB用于培养LX-07菌株。

1.2 菌种的鉴定

1.2.1 形态特征观察 菌株LX-07的形态特征分析参照《常见细菌系统鉴定手册》［7］和《伯杰细菌鉴定手册》［8］。

1.2.2 16S rDNA序列分析 提取菌株LX-07基因组总DNA［9］。16S rDNA的克隆采用细菌的通用引物27F(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)进行PCR扩增［10］。PCR反应体系(30μL)为:DNA(约25ng/μL)2μL，10×PCR Buffer 3μL，dNTPs(各2.5mmol/L)1.5μL，引物27F和引物1492R(各10μmol/L)各1.5μL，Taq酶(5U/μL)0.4μL，补水至30μL。PCR扩增程序为: 95℃变性5min;进行35次循环扩增反应(95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸90s);72℃延伸7min。扩增产物送至北京华大基因研究中心测序，测序后获得的16S rDNA序列在NCBI网站用Blast进行序列比对分析。

1.3 LX-07菌株拮抗物的分离

挑取固体平板上的LX-07单菌落接入NB培养基(50mL摇瓶装液量为10mL)，37℃，200r/min条件下振荡培养10～12h，得到种子液，将种子液以2%的接菌量转接于NB培养基，37℃，200r/min条件下振荡培养72h。发酵液4℃，11000r/min离心10min，弃菌体收集上清液备用，此上清液即为LX-07菌株分泌的拮抗物。

1.4 拮抗物的抑菌实验

将1.1中的7种病原真菌接种于PDA平板上，于28℃恒温培养箱培养3d，在菌落周围8mm处放上直径为6mm的无菌滤纸片，滤纸片上滴加10μL拮抗物，对照以等量的无菌水代替，继续培养14～18h，观察抑菌情况。

1.5 拮抗物稳定性研究

1.5.1 热处理 取8只离心管，每只离心管中添加1mL拮抗物(pH8.0)，分别于40、50、60、70、80、90、100、121℃条件下静置处理30min，室温(25℃)作为对照。以链格孢霉作为指示菌，按1.4的方法做抑菌实验，实验重复三次。

1.5.2 pH处理 取10只离心管，每只离心管中添加1mL拮抗物，用6mol/L的盐酸和10mol/L的NaOH于室温下分别调pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、 10.0、11.0、12.0，静置处理12h，再依次调pH至8.0，用无菌水定容至2mL，对照为原拮抗物，pH为8.0。抑菌实验同上，实验重复三次。

1.5.3 蛋白酶处理 取LX-07菌株拮抗物分别与猪胰腺胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K混合，并使酶的终浓度为0.5mg/mL，37℃酶作用2h后，100℃灭酶处理5min。其中胃蛋白酶处理时pH为2.0，猪胰腺胰蛋白酶处理时pH为8.0，蛋白酶K处理时pH为7.5，且含有10mmol/L的CaCl2。处理后调pH至8.0，以未处理的拮抗物作为对照，pH为8.0。抑菌实验同上，实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

2.1.1 LX-07的形态和培养特征 油镜下观察，LX-07菌体呈杆状，革兰氏染色结果为阳性，有芽孢。LX-07菌株在平板上37℃培养12h后，单个菌落呈圆形，乳白色，不透明，边缘整齐。

2.1.2 LX-07的16S rDNA序列及同源性分析LX-07的16S rDNA的序列长度为1545bp(图1)，BLAST程序比较分析发现它与枯草芽孢杆菌的56个菌株的序列同源性均达到99%，其中登录号为AB110598的枯草芽孢杆菌菌株的16S rDNA序列大小为1545bp，与LX-07的16S rDNA大小相同，它们序列同源性也达到了99%，证明LX-07为枯草芽孢杆菌。

图1 菌株LX-07的16S rDNA序列

2.2 拮抗物的抑菌实验

滤纸片法抑菌实验结果见图2，图中1、2分别为拮抗物和无菌水。结果表明，LX-07菌株的拮抗物对绿色木霉没有抑菌活性，对供试的其它6种病原菌具有不同程度的抑菌活性。其中对链格孢霉拮抗能力最强，对疣孢青霉的拮抗能力最弱。形成的抑菌圈在28℃放置4d后仍然存在。表明LX-07菌株具有抑菌谱广、拮抗活性稳定的特性。

2.3 拮抗物稳定性研究

2.3.1 热稳定性 图3表明:LX-07的拮抗物经40～100℃不同温度处理30min后，抑菌活性与室温对照相比没有变化。121℃处理30min后抑菌圈大小略有下降，但仍然保持对照的90%以上。

别小妹等［11］报道的枯草芽孢杆菌fmbR抗菌物质有极高的热稳定性，pH7.0，120℃处理3h仍然保持原来活性不变;Glulino Bernal［12］等的研究结果表明Bacillus subtilis产生的抗菌活性物质在100、120℃分别处理 20min后抑菌圈大小不变;Saravanakumar Kavitha等［13］报道的一种来源于 Bacillus polymyxa VLB16菌株的抗真菌蛋白在120℃处理15min后抑菌活性不受影响。

图2 LX-07拮抗物的抑菌图

图3 热处理对LX-07拮抗物稳定性的影响

可见，LX-07菌株拮抗物与报道的研究结果有相似性，都表现出很高的热稳定性。但由于处理的时间不同，因此结果并不完全一致。

2.3.2 pH稳定性 图4表明:LX-07的拮抗物在室温下经不同pH处理12h后，抑菌圈大小与对照相比不变，表明室温下，抗菌物质对pH的稳定性很好，在pH2.0～12.0的范围内，表现出很高的稳定性。

图4 pH处理对LX-07拮抗物稳定性的影响

别小妹等［11］报道的研究结果与本实验类似，不同之处是处理的时间不同。别小妹等的研究结果表明枯草芽孢杆菌fmbR抗菌物质在pH2.0～12.0范围内处理5h活性下降，而本实验处理的时间更长且活性不变，因此LX-07的拮抗物有更好的pH稳定性; San-Lang Wang等［14］的研究结果显示，Pseudomonas aeruginosa K-187分泌的一种抗真菌蛋白具有良好的热稳定性，100℃处理50min活性不变，但是对pH处理敏感，在pH5～7时最稳定，pH低于3.0时活性仅为原来的66%，高于11.0时抑菌活性完全丧失; G.Y.YU等［15］报道的 Bacillus subtilis的抗真菌物质iturin在pH3～11条件下，20℃处理24h，抗菌效果不受影响，而本实验的pH范围更宽。

2.3.3 蛋白酶稳定性 LX-07的拮抗物经0.5mg/mL的不同蛋白酶处理后的抑菌活性结果见图5。从图中可以看出，猪胰腺胰蛋白酶处理过的拮抗物活性不变，而胃蛋白酶和蛋白酶K处理过的活性分别为对照的60%和80%。结果表明，在酶的终浓度为0.5mg/mL的条件下，拮抗物对猪胰腺胰蛋白酶不敏感，对胃蛋白酶最敏感，对蛋白酶K也有较高的敏感性。

图5 拮抗物经不同蛋白酶处理后的抑菌活性

3 讨论

枯草芽孢杆菌应用于植物病害生物防治的研究已经有很多年的历史。尹志刚等［16］从樟树组织表皮内分离出一株枯草芽孢杆菌，在小麦的盆栽和大田实验中均对小麦纹枯病菌表现出良好的抑菌活性;邢介帅等［17］从枯草芽孢杆菌T2中纯化出一种高产蛋白酶，该酶对棉花枯萎病菌的孢子萌发、菌丝生长有明显的抑制作用。本实验研究的枯草芽孢杆菌LX-07产的抗真菌物质，能抑制多种植物病原真菌，显示了其在农业上的潜在应用价值。

国内外对于枯草芽孢杆菌抗菌物质稳定性研究有很多报道，本研究结果与以往的研究结论有相似之处，例如LX-07的拮抗物与别小妹等［11］报道的fmbR抗菌物质均有很高的热稳定性和pH稳定性，但是两者对蛋白酶处理的敏感度不同，而且后者只对细菌有抑菌活性，对真菌没有明显的抑制效果，LX-07的拮抗物则对植物病原真菌有广谱抑菌性。可见本研究与以往报道并不相同，因而该拮抗物有可能包含新的抗菌物质。

本研究下一步将对此拮抗物进行分离纯化，以得到纯的抗真菌物质，并对纯化后的抗真菌物质的理化特性做详细研究，以期为该抗真菌物质在农作物真菌病害防治上的应用提供依据。

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Identification of a bio-control bacteria LX-07 and characterizations of its antifungal substance

WANG Jin-ai1，XU Wen-tao1，2，LIANG Zhi-hong2，ZHANG Ya-nan1，LUO Yun-bo1，HUANG Kun-lun1，2，*
(1.Laboratory of Safety Detecting and Risk Assessment，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.Supervision，Inspection and Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

A bio-control bacteria LX-07 producing antifungal substance was isolated from the soil of maize roots.It was identified as Bacillus subtilis on the basis of morphological characters as well as the sequence analysis of 16S rDNA.The inhibitory test showed that the antifungal substance produced by LX-07 exhibited extensive antagonistic effect on quite a number of plant pathogenic fungi.Characterizations of the antifungal substance were assayed with Alternaria alternate as indicative bacteria.The results suggested that the antagonists were very stable within the tested range from 40℃ to 100℃ under pH8.0，but with 90%original activity after treated at 121℃ for 30min.In addition，the antifungal substance showed no change from pH2.0～12.0 under room temperature.With regard to the three proteinases，the results indicated that the antifungal substance was sensitive to pepsin and proteinase K，but it was very stable to trypsin.

Bacillus subtilis;antifungal;characterization

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0088-04

随着人民生活水平的提高，对食品安全性的要求也越来越高。为了解决农副产品产量和质量之间的矛盾，达到防治植物病虫害、减少化学农药使用量的目的，各国政府和人民越来越关注使用生物防治控制植物病虫害［1-2］。生物农药在保护环境、保证人类健康和农业可持续发展进程中，将发挥愈来愈重要的作用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)广泛存在于自然界中，是植物体内常见的内生细菌，对人体无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶［3-5］，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，因此成为近年来植物病害防治研究的热点。本实验室从玉米根系土壤中分离纯化得到一株拮抗菌株，通过滤纸片法证实该菌产生的拮抗物对常见的植物病原真菌有不同程度的抑菌活性。本文根据该菌株的形态特征及16S rDNA序列分析对其进行了分类鉴定，并对其产生的拮抗物的理化性质进行了研究，为正确选择抗菌活性物质的分离纯化工艺和该内生细菌的进一步研发提供理论依据。

2009-12-22 *通讯联系人

王金爱(1984-)，女，硕士，主要从事抗菌蛋白的提取、分离和纯化研究。

国家高技术研究与发展计划(863)项目(2006AA10Z440);国家自然基金项目(308007708)资助。