百里香挥发油成分分析及急性毒理学实验研究

闫子娇，张有林，于月英

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

百里香挥发油成分分析及急性毒理学实验研究

闫子娇，张有林*，于月英

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

百里香全草是一味中药，香味浓郁，在食品中多用作除膻调料，但其化学成分作用机理和毒理学特性尚不清楚。采用水蒸汽蒸馏法提取甘肃镇原百里香挥发油，研究三种不同保藏方法保藏的百里香全草的挥发油提取得率，以冷冻保藏效果最好。同时利用GC-MS对甘肃镇原百里香挥发油成分分析研究，分离出82个峰，并且确认了52种化合物。通过对小鼠的急性毒理学实验，初步确定甘肃镇原百里香挥发油的急性毒性致死量（LD）为4.00mL/kg和半致死量（LD50）3.02mL/kg。

百里香，挥发油，成分分析，GC-MS，毒理实验

百里香（Thymus serpyllum L.）［1］为唇形科百里香属植物，在全世界约有300～400种，主要分布于地中海沿岸、非洲北部及亚洲温带地区。我国有12种［2］，主要分布于甘肃、陕西、青海、山西及河北，多生于海拔1100～3600m的黄土丘陵和沙地上。百里香植物是一味中药，全株具有特殊芳香气味，并且具有除膻作用，可作为制作香精和食用香料的重要原料。近年来，国外对百里香植物挥发油的研究较多［3］，并将其应用于医疗、保健、化妆品、食品等方面。目前已分离出百里香挥发油成分最多至96种［4］，鉴定出挥发油成分最多至68种［5］。本文采用GC-MS法分析了我国甘肃省镇原县百里香挥发油的化学成分，并使用百里香挥发油对小鼠进行了急性毒理学实验，为我国百里香资源的进一步研究和开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

百里香全草 采于甘肃省镇原县新城乡，分别采用冷冻保藏（-18℃）、低温保藏（5℃）、自然阴干三种方法储存；小鼠 西安交通大学医学部动物中心培养，昆明种小白鼠，出生45d，体重22～26g；鼠粮常规鼠粮。

提取设备 实验室自制蒸馏-冷凝装置；分析仪器 HP6890GC/5973MSD气-质联用分析仪（美国惠普公司），附G1701BA-B.0 1.00 ChemStation软件。

1.2 实验方法

1.2.1 百里香挥发油的提取［6］将冷冻保藏（-18℃）、低温保藏（5℃）、自然阴干（室内阴干）和新鲜全草（对照）四种百里香全草各取1000g，在实验室自制蒸馏-冷凝装置的蒸馏锅内蒸馏1.0h，获得1000mL蒸馏液，吸取蒸馏液中漂浮的挥发油，计算挥发油得率，计算公式为：

1.2.2 百里香挥发油的GC-MS分析条件［7-8］

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱：HP-5MS，5%苯甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；进样口温度：200℃；柱室温度：60℃（保持5min），以 8℃/min升温速率升至 150℃（保持10min）；载气：高纯氦气；柱前压 71kPa，流速lmL/min，分流比15∶1。

1.2.2.2 质谱条件 接口温度：280℃；电离方式：EI；电子能量：70eV；离子源温度：250℃；四极杆温度：130℃；调谐方式：标准调谐；质量扫描方式：SCAN；溶剂延迟：1.5min；扫描范围：10～550amu；电子倍增器电压：1635V；G1033A，D.01.00NlST98标准质谱检索库。

1.2.3 百里香挥发油的急性毒理学实验［9］急性毒理实验［10］，是一次性投较大剂量后观察动物的变化，观察期大约为2周，从而判定动物的致死量（LD）和半致死量（LD50）。半致死量是指实验动物死亡一半的投药量。如果投药量大于5000mg/kg，无死亡，可认为该品毒性较低，无需做致死量精确测定。

1.2.3.1 小鼠0%～100%致死用量预实验 选用西安交通大学医学部动物中心培养的昆明种小白鼠，出生45d，体重22～26g。将小鼠致死率0%～100%的剂量范围初定为1.0～5.0mL/kg，实验小鼠按不同剂量分为5组，每组4只（雌雄各半），一次性灌胃，每组灌胃剂量为：1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL/kg。

1.2.3.2 百里香挥发油对小鼠急性毒理实验 使用改良寇氏法［11］，根据预实验数据，将小鼠致死率0%～100%的剂量范围初定为1.50～4.00mL/kg，实验小鼠按不同剂量分为8组，每组10只（雌雄各半），一次性灌胃。由，其中r为组距，b为100%致死剂量，a为0%致死剂量，n为组数，计算r≈1.15。根据r分组，每组灌胃剂量为：1.50、1.73、1.98、2.28、2.62、3.02、3.47、4.00mL/kg。

1.2.3.3 灌胃后观察 给小鼠灌胃后每日观察1次，观察记录在14d中毒表现、死亡数和死亡时间，得出LD（小鼠致死量）及LD50（小鼠半致死量）。对于死亡小鼠，解剖观察其心、肝、脾、肺、肾和胃等主要器官的组织变化。实验结束时称取存活小鼠并记录体重，并处死尸检。

2 结果与分析

2.1 不同保藏方法百里香挥发油的得率

经蒸馏法提取测得不同保藏方法得率分别为：冷冻鲜藏全草0.21%，低温鲜藏全草0.10%，自然干燥全草0.15%，对照（新鲜全草）0.22%。由此看出，冷冻保藏可以较好地保存百里香的挥发油，其原因可能是低温减缓了香味物质的挥发。

2.2 百里香挥发油的成分鉴定

取百里香挥发油0.2μL进样，进行分离，得总离子流图见图1。将图1中分离出的各组分提取质谱图经用NIST98标准谱库检索并与文献［12-14］核对，确认了52种成分，采用气相色谱面积归一化法［15］确定了各种成分的相对质量分数，结果见表1。

图1 百里香挥发油成分的总离子流色谱图

分析鉴定结果表明，百里香挥发油中52种成分共占挥发油总量的98.51%，从所鉴定的52种成分中可见，其主要为香荆芥酚、百里香酚、香芹酮、龙脑、麝香草酚、异麝香草酚、2-亚甲基-4，8，8-三甲基-4 -乙烯基双环［5，2，0］壬烷、醋酸百里酚酯等，其中香荆芥酚含量为24.42%，百里香酚含量为21.60%、香芹酮13.67%、龙脑9.04%。

2.3 百里香挥发油小鼠急性毒理学实验结果

2.3.1 急性中毒症状记录 小鼠经过量（5.00mL/kg）百里香挥发油灌胃后，出现下列症状：心跳加快，逐渐不规律，发出不正常咯咯声，平衡性变差，走路摇摆，步伐不稳，皮肤呈现不正常蓝紫色（尾部血管尤为明显），耳朵充血，眼球充血，四肢抽搐，行动困难，呼吸停止。

2.3.2 致死量（LD）和半致死量（LD50） 从表2可知，大剂量百里香挥发油灌胃（3.47mL/kg体重）的结果导致小鼠的死亡率达到了80%，说明百里香挥发油并非无毒，只有在≤1.73mL/kg体重的剂量时，才具有安全性。

表2 小鼠玫瑰精油灌胃实验结果

由此可见，根据美国科学院毒性物质等级划分标准［16］（按物质的半致死剂量LD50值划分）：①“0”：无毒性，LD50＞15.0g·kg-1；②“1”：实际无毒性，5.0g·kg-1＜LD50＜15.0g·kg-1；③“2”：轻度毒性，0.5g·kg-1＜LD50＜5.0g·kg-1；④“3”：中度毒性，50.0mg·kg-1＜LD50＜500.0mg·kg-1；⑤“4”：毒性，LD50＜50.0mg·kg-1。天然的百里香挥发油是一种具轻度毒性的产品，毒性程度为2度。其 LD50为3.02mL/kg·DW，其LD值为4.00mL/kg·DW。

2.3.3 对主要脏器的影响 灌胃后24h内小鼠出现轻微中毒症状，24h后，症状逐渐消失，至14d，处死所有未致死小鼠，解剖，观察1号、2号组小鼠心、肝、脾、肺、肾和胃等脏器，未见有异常改变。

3 结论

经研究，冷冻保藏（-18℃）可以最大限度地保存百里香全草的香气物质，可应用于百里香的大批量贮藏加工。甘肃省镇原县百里香挥发油成分以酚、烯、酮、醇类化合物为主，主要有香荆芥酚（24.42%）、百里香酚（21.60%）、香芹酮（13.67%）、龙脑（9.04%）、石竹烯氧化物（6.89%）、2-亚甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基双环［5，2，0］壬烷（6.06%）、麝香草酚（5.03%）、酸百里酚酯（4.37%）、醋大根香叶烯-D（4.21%）、异麝香草酚（4.15%）、香叶基丙酮（3.67%）、1-甲氧基-3-甲基-2-异丙基苯（3.56%）。经毒理学实验，测定百里香挥发油的LD为4.00mL/kg，LD50为3.02mL/kg，为低毒物品，可作为日用化工香精和食品添加剂原料。

表1 百里香挥发油主要化学成分及含量

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［3］Miguei G，Simoes M，Figueirdo A C，et al.Composition and antioxidant activities of the essential oils of Thymus caespititius，Thymus camphorates and Thymus mastichina［J］.Food Chemistry，2004，86：183-188.

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［13］丛浦珠编.质谱学在天然有机化学中的应用［M］.北京：科学出版社，1987.

［14］丛浦珠，苏克曼.分析化学手册（第二版）［M］.北京：化学工业出版社，2000.

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Study of composition and emergency toxicology test of thymus

YAN Zi-jiao，ZHANG You-lin*，YU Yue-ying
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Thymus is a traditional Chinese medicine with strong fragrance，which is usually used as seasoning wiping off rank odor in food.The chemical composition of its chemical composition and its toxicologic character are still not clear.The volatile oil in thymus collected in town of Zhenyuan in Gansu Province was extracted by means of wet distillation.After comparison of the yield from three different ways of preservation，the cryopreservation showed the best effect.GC-MS was used to analyze the ingredients in the volatile oil in thymus.82 peaks were separated and 52 kinds of compound were verified.The LD and LD50of volatile oil in Thymus was 4.00mL/kg and 3.02mL/kg through the research of acute toxicity test，respectively.

thymus；volatile oil；composition analysis；GC-MS；toxicological test

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0144-04

2010-01-19 *通讯联系人

闫子娇（1983-），女，研究方向：食品科学。