阴离子交换色谱法一步分离牛初乳中的SIGA

章飞燕，叶鹏程，任其龙

（浙江大学天然药物与精细分离研究室，浙江杭州310027）

阴离子交换色谱法一步分离牛初乳中的SIGA

章飞燕，叶鹏程，任其龙*

（浙江大学天然药物与精细分离研究室，浙江杭州310027）

利用强碱3#树脂阴离子交换色谱法从牛初乳中分离获得分泌型免疫球蛋白A。考察了缓冲液pH和离子强度对所获免疫球蛋白A产品纯度的影响，获得从牛初乳中分离免疫球蛋白A的最优条件为pH 7.0，离子强度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲液，最终可获得纯度为91.24%的免疫球蛋白A，回收率达到47%。因此，利用以强碱3#树脂为基质的阴离子交换色谱分离牛初乳中的免疫球蛋白A具有很好的发展潜力。

分泌型免疫球蛋白A（sIgA），牛初乳，阴离子交换色谱，分离

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

平衡缓冲液 离子强度为0.03mol/L，pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.3、7.5、8.0的磷酸钠缓冲液、离子强度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L，pH为7.0的磷酸钠缓冲液；洗脱缓冲液 在平衡缓冲液中加入0.5mol/L的NaCl；透析袋 截留分子量MW为3500Da；强碱3#树脂 上海华震科技贸易公司，淡黄色透明球状颗粒，聚苯乙烯-二乙烯苯共聚基体，离子交换基为季氨基［-N（CH3）3OH］，粒度范围0.3～1.2mm；牛初乳原料样品 牛初乳离心脱脂后的乳清经过40%的硫酸铵沉淀，获得盐析产品，sIgA的含量约为16%～19%。

XK 16玻璃空柱管 i.d.1.6cm，Phamacia Biotech公司；Waters高效液相色谱仪 配可变波长紫外检测器，美国Waters公司；DELTA 320 pH计 DELTA公司；Mini-PROTEAN电泳系统 美国 Bio-rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛初乳样品中蛋白组成的分析

1.2.1.1 流动相的配制 A液（pH7.0，0.05mol/L磷酸盐缓冲液）：8.955g磷酸氢二钠+7.802g磷酸二氢钠，加纯净水定容至1000mL；B液（pH2.5，0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液）：3.752g甘氨酸+纯净水250mL +150mL 0.2mol/L盐酸，双蒸水溶解并定容至1000mL。

1.2.1.2 色谱条件 色谱柱：Hi-Trap Protein G柱，1mL；色谱柱的平衡：用纯净水洗柱（流速1mL/min）约30min至基线平衡，再用A液平衡色谱柱至基线稳定；检测波长：280nm；进样量：60!L。

1.2.1.3 梯度洗脱 按表1参数进行梯度洗脱。

表1 HPLC梯度洗脱表

1.2.2 牛初乳免疫球蛋白在强碱3#树脂层析柱中的分离 湿法装柱，稳定后柱高16.3cm。用平衡缓冲液平衡强碱3#树脂层析柱，设定流速为0.5mL/min。待基线稳定后，进样1mL（牛初乳原料样品浓度50mg/mL），用平衡缓冲液将不被吸附的IgG全部直接洗脱出来，收集第一组峰，称为组分A。再用含有0.5mol/L NaCl的洗脱缓冲液洗脱至检测不到Ig，收集第二组峰B，称为组分B。用0.8mol/L的NaCl溶液洗涤强碱3#树脂层析柱大约2BV再生。

1.2.3 组分B的浓缩 收集的组分B用PEG-6000在4℃下透析浓缩10倍。

1.2.4 非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 浓缩胶5%，分离胶8%。

2 结果与讨论

2.1 牛初乳样品在HPLC上的分析结果

由于在中性条件下，IgG与蛋白G之间有很强的亲和性，只有在强酸条件下（pH2～3）才能被洗脱下来，因此峰2（7.0～8.0min）对应的即为IgG，而中性条件下不吸附的为富含 sIgA的组分，与图中峰 1（0.4～2.0min）所对应。因为缺少标样，本文所有含量分析均由HPLC谱图中的峰面积之比得到。

2.2 pH的影响

因为免疫球蛋白的等电点不是一个特定的值，而是一个范围，所以在不同pH的缓冲液条件下，蛋白表面的带电量也不同，导致它在强碱树脂上的吸附行为的差异。因此考察在离子强度为0.03mol/L的条件下，不同pH（6.0、6.5、7.0、7.3、7.5和8.0）的缓冲液对组分B中sIgA的纯度和收率的影响，结果如图2所示。

图1 牛初乳溶液的HPLC分析图

图2 磷酸盐缓冲液pH对组分B中sIgA纯度和收率的影响

由图2可知，当缓冲液pH＜7.0时，组分B中sIgA的纯度随着pH的升高而升高，这是因为当溶液pH升高时，sIgA分子所带负电荷的量增多，使得sIgA在强碱树脂上的吸附增多；当缓冲液pH＞7.0时，IgG分子所带的正电荷减少，部分甚至带上了负电荷而被吸附在强碱树脂上，所以组分B中sIgA的纯度随着pH的升高而降低。因为sIgA的吸附量随着溶液pH的增大而增大，所以组分B中sIgA的收率随着pH的增大而增大。

因此，在溶液离子强度为0.03mol/L的条件下，pH为7.0是牛初乳免疫球蛋白在强碱3#树脂上分离的最佳pH。

2.3 离子强度的影响

与缓冲液pH类似，缓冲液的离子强度能够改变免疫球蛋白在强碱树脂上的吸附行为，从而导致组分B中sIgA纯度和收率的变化。在溶液pH为7.0的条件下，考察溶液离子强度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L条件下，牛初乳免疫球蛋白在强碱3#树脂中的分离，从而获得分离IgG和sIgA的最佳溶液离子强度，结果如图3所示。

图3 磷酸盐缓冲液离子强度对组分B中sIgA纯度和收率的影响

由图3可知，在低离子强度的缓冲溶液中，IgG不能有效地被顶替下来，而被保留在层析柱中，并在洗脱过程中，被更高离子强度的洗脱液与sIgA一起洗脱下来。而随着缓冲液离子强度的增大，顶替作用增强，使得组分B中IgG的含量减少，因此sIgA的纯度提高。但随着溶液离子强度的进一步提高，sIgA在顶替过程中的损失也变大，使得组分B中sIgA的纯度反而降低。又因为溶液离子强度越高，洗脱能力越强，使得相同条件下，吸附到树脂上的蛋白分子减少，因此组分B中sIgA的收率随着缓冲液离子强度的增大而降低。

综上所述，缓冲液pH为7.0的条件下，在强碱3#树脂上分离 IgG和 sIgA的最佳离子强度为0.03mol/L。

2.4 牛初乳免疫球蛋白在磷酸盐缓冲液中的层析分离

根据2.2和2.3实验所获得的最佳缓冲液条件（pH7.0，0.03mol/L磷酸盐缓冲液），将牛初乳原料样品在强碱3#树脂上进行层析分离，获得如图4所示的洗脱曲线。

图4 牛初乳原料样品在强碱3#树脂上层析分离的洗脱曲线

2.4.1 HPLC分析 如1.2所述收集组分A和组分B，分别在HPLC系统上检测分析。根据液相图谱峰面积之比，计算获得组分A和组分B中IgG和sIgA的含量组成，结果如表2所示。

表2 牛初乳上样溶液、组分A和组分B的蛋白组成分析结果

2.4.2 非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析非还原性SDS-PAGE是在蛋白样品处理时，样品缓冲液中不加入还原剂巯基乙醇，因此免疫球蛋白分子不会因二硫键被打断而变成重链和轻链的片段。

将牛初乳上样溶液、组分A和浓缩10倍后的组分B用非还原性SDS-PAGE检测，鉴定其中所含的免疫球蛋白种类，结果如图5所示。

从图5的电泳结果中可以看到，组分A中含有大部分的IgG（Mr=160kDa）和少量的sIgA（Mr= 390kDa），而组分B只观察到sIgA的条带，IgG可能因为含量太低而无法检测到，这也说明了组分B中含有纯度较高的sIgA，与液相检测所得到的结果是一致的。

图5 非还原性SDS-PAGE检测结果

3 结论

经离心脱脂后得到的牛初乳乳清通过40%的硫酸铵沉淀，获得的盐析产品中含有约16%～19%的sIgA。通过以强碱3#树脂为基质的阴离子交换色谱可以将sIgA从此盐析产品中分离出来。在磷酸盐缓冲液体系中，sIgA产品的纯度随着溶液pH和离子强度的增大，均先升高后降低，收率随着溶液pH的升高而略有增加，离子强度对收率的影响并不明显。pH7.0，离子强度为0.03mol/L的磷酸盐溶液为分离的最优条件。在32.8mL的强碱3#树脂层析柱中，当上样量为 1.52g/mL强碱 3#树脂，上样浓度为50mg/mL时，在最优条件下可获得纯度为91.24%的sIgA产品，收率达到47.00%。

［1］陆东林，曹劲松，王芸张，等.中国乳制品工业行业规范——生鲜牛初乳RHB 601-2005［S］.新疆畜牧业，2006（2）：25-26.

［2］傅维琦，吴绵斌，李向平，等.牛初乳中主要活性物质开发的最新进展［J］.食品与发酵工业，2003，29（4）：76-80.

［3］Mahi Josrpine.Colostrum：Life's First Food［J］.Total Health，1999，21（2）：22-24.

［4］Hilpert H，Brüssow H，Mietens C，et al.Use of bovine milk concentrate containing antibody to rotavirus to treat rotavirus gastroenteritis in infants［J］.The Journal of Infectious Diseases，1987，156（1）：158-166.

［5］Playne MJ，Bennett LE，Smithers GW.Functional dairy foods and ingredients［J］.Australian Journal of Dairy Technology，2003，58（3）：242-264.

Single-step purification of sIgA from bovine colostrums by anion-exchange chromatography

ZHANG Fei-yan，YE Peng-cheng，REN Qi-long*
（National Laboratory of Secondary Resources Chemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China）

A fraction containing sIgA（sIgA-rich fraction）was prepared from bovine colostrum by anion exchange chromatography using alkali resin.The effect of changing buffer properties（pH and ionic strength）on purity of sIgA was studied.The best result was sIgA purity increasing from 16.31%in bovine colostrum solution to 91.24%in the eluting fraction with a recovery of 47%at the condition of pH 7.0，0.03mol/L sodium phosphate.These results suggested that the anion exchange chromatography using alkali resin was a potential process for sIgA purification from bovine colostrum.

secretory immunoglobulin A（sIgA）；bovine colostrum；anion-exchange chromatography；separation

TS252.1

B

1002-0306（2011）02-0261-03

牛初乳（Bovine Colostrum）是指从正常饲养的、无传染病和乳房炎的健康母牛分娩后72h内所挤出的乳汁［1］。它是一种淡黄色、味微苦的粘稠状液体，含有大量的免疫因子和生长因子，是自然界中最重要的生物资源之一。牛初乳中所含的生物活性物质主要包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、胰岛素样生长因子以及各种酶类等，含量比常乳高10～100倍，这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等一系列的生物功能［2］。早在几千年前的古印度就有食用牛初乳的记载［3］。1977年Hilpert提出了将牛初乳乳清中的免疫球蛋白富集后应用于婴儿奶粉中的设想；1987年Mietens等人证实口服含有免疫球蛋白的牛奶，就能有效预防轮状病毒、痢疾杆菌等病菌的侵害［4］；1995年Lehto E.等人提出动物初乳可作为一种功能性的食品基料［5］。我国目前也有多家企业在进行牛初乳相关产品的开发，但大部分都停滞在对牛初乳IgG的制备，牛初乳sIgA的开发还比较落后。而牛初乳IgG只能部分取代母乳中sIgA的功能，因此，为了高效地综合利用牛初乳资源中的免疫球蛋白，有必要开发出合理的分离技术路线，获得高纯度的sIgA产品。本文主要侧重于经脱脂、盐析处理后得到的牛初乳样品中sIgA的分离纯化工艺的研究，开发一种能简单快速生产高纯度牛初乳sIgA的工艺路线。

2010-03-02 *通讯联系人

章飞燕（1984-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物分离。