拮抗细菌B-05的鉴定及发酵条件初探△

蒲盛才，韦中强

(重庆市药物种植研究所，重庆 南川 408435)

重庆市科技攻关计划项目(CSTC,2009AC5134)

*蒲盛才，E-mail：pushengcai1@163.com

拮抗细菌B-05的鉴定及发酵条件初探△

蒲盛才*，韦中强

(重庆市药物种植研究所，重庆 南川408435)

目的为了初步鉴定从土壤中分离的一株拮抗性能强且抗性稳定的菌株，并探索其抗菌物质的最佳发酵条件。方法对拮抗菌一般特征采用苯酚品红染色法，芽孢采用孔雀石绿染色法，鞭毛采用西萨-基尔(Ceseres-Gill)染色法，生理生化测试采用常规的细菌生理生化测试方法进行鉴定。发酵条件分别开展培养基、发酵pH值、温度、时间的筛选。结果经初步鉴定拮抗细菌B-05属枯草芽孢杆菌。抗菌物质最佳发酵条件为：在pH7.0的PDA培养基中，25℃恒温培养96h后发酵液的抑菌效果最佳。结论发酵条件及抗菌性研究为抑菌物质的工厂化生产和应用提供了有价值的参考依据。

白芷根腐病菌；拮抗细菌；鉴定；发酵条件

白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f为多年生草本植物，以根入药，具解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓的功能。白芷在中国西南地区主产于四川遂宁和重庆南川。白芷根腐病极其严重，常发生于白芷成熟期，时值7月下旬至8月中旬高温高湿期间，发病率急剧上升，引起白芷块根平均腐烂率达16%左右，重者可达30%以上。白芷根腐病由子囊菌中的菜豆壳球孢MacrophominaphaseolinaGoid引起[1]，微菌核是其主要存在形式。白芷植株自身带菌而致病，通常在白芷苗期和生长期发病症状不明显，采挖期发病率急剧上升，加速腐烂，有时可造成全部烂掉，产量损失严重。生产中常采用硫磺熏蒸的方法防治该病，但近年发现，硫磺熏蒸严重影响白芷质量，可使其主要有效成分——香豆素类物质降低70%左右[2-3]。鉴于硫磺熏蒸在白芷根腐病防治中的弊端，生物防治逐渐引起国内外研究学者的重视。迄今，未见有关白芷根腐病生物防治的研究报道。自1997年起，课题组以白芷根腐病菌为靶标菌，着手从土壤﹑植株体表﹑果实﹑植物茎杆中筛选生防菌株，最终从土壤中筛选出一株活性强、抗谱广的细菌菌株B-05。抗菌活力试验结果表明，除黑色曲霉菌外，B-05对供试25种真菌中的24种都表现极强的抗菌作用。5%～10%的B-05发酵液即可完全抑制白色曲霉菌、白芷根腐病菌、新型隐球菌、红色酵母菌、黑色酵母菌和热带假丝等真菌的生长。同时发现，B-05发酵液对金黄色葡萄球菌、肠球菌和枯草杆菌等革兰氏阳性细菌也表现出极强的抗菌作用，5%的B-05发酵液即可完全抑制金黄色葡萄球菌的生长(待发表)。上述研究结果表明，B-05具有重要的研究价值，有望开发新的抗菌药物。现将拮抗细菌B-05的初步鉴定及发酵培养基的筛选结果报告如下。

1 材料与方法

1.1菌种

拮抗细菌B-05，由重庆市药物种植研究所分离保存。指示菌：白芷根腐病菌，由重庆西南农业大学裴炎教授惠赠。

1.2培养基

PDA液态培养基用于拮抗细菌B-05的培养，PDA固体培养基用于白芷根腐病菌的培养。

1.3菌种的鉴定

1.3.1培养性状 营养琼脂培养基(NA)上28℃培养2d后观察培养性状。

1.3.2形态学观察 观察细菌的形态﹑包括细菌体形态﹑芽孢形态以及鞭毛等重要鉴别特征。一般特征采用苯酚品红染色法，芽孢采用孔雀石绿染色法，鞭毛采用西萨-基尔(Ceseres—Gill)染色法，其余特征观察参考文献方法[4]。

1.3.3生理生化测试 采用常规的细菌生理生化测试方法[5]。

1.4培养基的筛选试验

本试验共涉及12种培养基，分别为PDA液态培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL)、Richard溶液(硝酸钾10g，磷酸二氢钾5g，七水硫酸镁2.5g，三氯化铁0.02g，蔗糖50g,蒸馏水1000mL)、肉汁胨培养基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，蒸馏水1000mL。玉米粉培养基(玉米粉30g，蒸馏水1000mL)、PGY培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖1g，蒸馏水1000mL)、BPY培养基(蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉5g，NaCl5g，葡萄糖5g，蒸馏水1000mL)、LB培养基(酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl10g，蒸馏水1000mL)、葡萄糖酵母粉培养液(葡萄糖10g，酵母粉10g，蒸馏水1000mL)、Sabouraud氏培养基(葡萄糖40g,蛋白胨10g，蒸馏水1000mL)、淀粉培养基(可溶性淀粉10g，NaNO31g，NaCl0.5g，KH2PO40.3g，蒸馏水1000mL)、马铃薯汁培养基(去皮马铃薯200g，蒸馏水1000mL)、牛肉膏淀粉培养基(牛肉膏20g，蛋白胨10g，淀粉20g，pH7.2)。按以上比例配制液体培养基，摇匀后分装50mL/瓶，0.1MPa·cm-2、121℃高压灭菌20min，冷却接种，接种量为50μL，接种浓度于25～30℃条件下培养96h，分别用移液管取2.6mL发酵液于50mL/瓶的PDA固体培养基中(相对浓度为5%)，121℃高压灭菌20min，净化工作台上倒平皿(Ф90mm)，每瓶倒3皿，冷却后将白芷根腐病菌饼(Ф7mm)接种到平皿培养基中央(注意菌种面必须接触培养基)。PDA固体培养基加清水设空白对照，在恒温培养箱中25～30℃培养48h后观察。

1.5发酵pH值、温度、时间的研究

该实验研究了拮抗细菌B-05的各种发酵液的初始pH值、发酵温度、发酵时间对试验菌株抑菌作用的影响。综合全部筛选结果即得最优发酵条件。

2 结果与分析

2.1拮抗菌株的培养特征、形态观察及生理生化测试结果

菌株B-05在NA平板培养观察，单个菌落乳白色，表面光滑有黏液，湿润透明，圆形，有中央隆起，镜检为杆状革兰氏染色阳性，周身鞭毛，产生芽孢，芽孢椭圆形，在菌体中央或一端形成，兼性厌氧。生理生化测试：葡萄糖﹑甘露利用，淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化、产气实验、V-P实验、吲哚实验和过氧化氢酶实验均呈阳性。综合菌种上述特征结合参考文献[6]，初步判断拮抗细菌B-05为枯草芽孢杆菌。

2.2拮抗细菌B-05发酵液抗白芷根腐病菌测试结果

各种培养基B-05发酵液抗白芷根腐病菌实验,培养48 h后观察、测量、计算抑菌率，其实验结果见表1。

抑菌率计算公式：抑菌率=(对照菌落生长半径-处理菌落生长半径)/对照菌落生长半径×100 %。

表1 不同培养基的B-05发酵液对白芷根腐病菌的抑菌率

注：(1) 测量直径时，包含菌丝翻长接触含药培养基的一段菌丝，其抑菌率实质比计算得出的还要高，下同；(2)*为0.05水平显著，** 为0.01水平显著

由表1可见，培养基对B-05的抑菌效果有重要影响，其中PDA培养基发酵液的抑菌效果最好。所以在后续试验中发酵培养基均为PDA培养基。

2.3初始pH值的考察

将B-05分别接种到初始pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的PDA培养基中测定抑菌活性，考察最适pH值。

表2 初始pH值对抑菌作用的影响

注：*为0.05水平显著，** 为0.01水平显著

由表2可见PDA培养基初始pH值在中性微偏酸的条件下抑菌效果最好，强酸强碱都会导致抑菌效果的下降。

2.4发酵温度的考察

将试验菌株B-05分别在20,25,30,35℃发酵48h后测定发酵液的抑菌活性，考察最适发酵温度。

表3 发酵温度对抑菌作用的影响

注：*为0.05水平显著，** 为0.01水平显著。

由表3可知，25 ℃左右时试验菌株B-05抑菌效果最佳，温度过高或过低均影响B-05菌株的抑菌效果。温度太低，菌体生长缓慢，发酵时间长；温度过高菌体虽然生长较快，但会影响抑菌物质的产生，所以后续试验中发酵温度均为25 ℃。

2.5发酵时间的考察

分别测定发酵48，72，96，120h后B-05菌株发酵液的抑菌活性，考察最适发酵时间。除发酵时间外其余发酵条件均相同。

表4 发酵时间对抑菌作用的影响

注：*为0.05水平显著，** 为0.01水平显著

由表4可知，B-05抑菌效果随发酵时间的变化而变化，发酵96 h时发酵液的抑菌效果最佳，发酵时间过长，抑菌率反而下降，可能是由于代谢产物的积累，造成了抑菌物质的减少，所以在后续试验中发酵时间均为96 h。

3 结论

[1] 张玉方，余红梅，欧阳铁.白芷根腐病病原菌生物学特性研究[J].西南农业大学学报，1995，17(6)：514.

[2] 李宏宇，戴跃进，谢成科.中药白芷硫熏前后香豆素类成分含量的比较[J].中国中药杂志，1991，16(1)：27.

[3] 张玉方，余红梅.硫熏对白芷香豆素类成分含量的影响研究[J].中国中药杂志，1997，22(9)：536.

[4] 方中达.植病研究方法[M].北京：农业出版社，1979：194-196.

[5] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：184.

[6] 布坎南.R.E,吉本斯.N.E.伯杰氏细菌鉴定手册[M].第八版.北京：科学出版社，1984：729-734.

StudyonthePreliminaryIdentificationandFermentationConditionofAntagonisticB-05Strain

PU Sheng-cai，WEI Zhong-qiang

(ChongqingInstituteofMedicinalPlantCaltivation,Nantong408435,China)

Objective: The aim of this study was to identify initially a strain with strong antagonistic action and stable resistance, which was separated from the soil and to explore the best optimum fermentation conditions of its antibacterial substance.MethodsFor the general characteristics of antagonistic bacteria, carbol fuchsia dyeing method was used. As for a gemma, schaeffer-fulton dyeing method was adopted. Ceseres-Gill dyeing method was introduced to the flagellum and the normal bacterial physiological and biochemical test methods was for physiological and biochemical test. The optimum fermentation conditions comprised developing medium and the sifting of pH value, temperature and time.ResultsAfter the initial identification, antagonistic bacteria B-05 was included by Bacillussubtilis. The best optimum fermentation conditions for the antimicrobial substances was kept constant temperature of 25 ℃ for 96 h in the pH 7.0 PDA medium.ConclusionThe optimum fermentation conditions and the antimicrobial study offered valuable references for the production and application of antibacterial substances.

MacrophominaphaseolinaGoid; Antagonistic bacteria; Identification; Fermentation

2011-01-07)