箱式气调贮藏对采后蓝莓生理生化变化的影响

孟宪军，姜爱丽，，胡文忠，田密霞，刘程惠

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161; 2.大连民族学院生命科学学院，生物化学工程国家民委-教育部重点实验室，辽宁大连116600)

箱式气调贮藏对采后蓝莓生理生化变化的影响

孟宪军1，姜爱丽1，2，胡文忠2，田密霞1，刘程惠2

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161; 2.大连民族学院生命科学学院，生物化学工程国家民委-教育部重点实验室，辽宁大连116600)

以伯克利品种蓝莓为试材，研究了在1℃的5%O2+10%CO2;5%O2+20%CO2和5%O2+30%CO2的箱式气调贮藏条件下的生理生化变化情况。每20d测定一次酶促防御系统的酶活性、抗病性相关酶活性和非酶促防御系统的抗氧化物质的含量，并测定呼吸速率、木质素含量、果实硬度和腐烂率。实验结果表明:与对照相比，3种CO2浓度的箱式气调贮藏条件均可启动酶促防御系统，使过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性得到提高，同时也减慢了还原型谷胱甘肽(GSH)含量下降的速率，增加了VC含量。3种浓度的CO2处理还可有效减慢呼吸速率，抑制腐烂的发生并可有效提高木质素含量和果实硬度，其中5%O2+30%CO2更有利于延缓衰老进程，可使有效贮藏期延长至95d左右。研究认为:蓝莓对高浓度CO2有很强的耐力，高浓度CO2箱式气调用于蓝莓贮藏具有很好的保鲜效果。

箱式气调贮藏，蓝莓，高浓度CO2，生理生化变化

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝金品种蓝莓(Vaccinium spp.) 采自大连大学蓝莓基地;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、甲醇、愈创木酚、邻苯二酚、标准抗坏血酸、草酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、EDTA-Na2、H2O2、巯基乙醇、硼酸、硼砂、苯丙氨酸、甲硫氨酸、氮蓝四唑、核黄素、硫酸、聚乙烯吡咯烷酮、三氯乙酸、还原型谷胱甘肽、二硫代硝基苯甲酸 以上试剂均为分析纯;CO2气体和N2气体钢瓶装 大连安瑞森特种气体有限公司。

CHECK POINT型气体检测仪 丹麦产;PL203精密电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司; Lamda-25紫外可见分光光度计 美国PE公司; GC-2010型气相色谱、LC-20AB型高效液相色谱仪日本岛津公司;BR4i型台式高速冷冻离心机 法国Jouan公司;T25型匀浆机 德国IKA公司;TA.XT Plus型质构仪 英国SMSTA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验材料预处理 选择色泽、成熟度一致、大小均匀、无病虫害和机械伤的果实，采后立即运至实验室，经1℃12h的预冷之后进行箱式气调贮藏实验;气调箱50.5cm×32.5cm×30cm严格密封的塑料密闭箱;气体指标体积分数分别为5%O2+10% CO2;5%O2+20%CO2和5%O2+30%CO2，用体积分数均为99.9%的高浓度CO2气体和N2气体(钢瓶装)进行配气，气体检测仪检测气体浓度。以不经配气的空气箱作为对照。箱体均装有不同的调气嘴，通过预实验，选用的调气嘴可使气体指标在20d的时间内变化幅度≤20%。每个气调箱装样品3kg，每处理做3个重复，贮藏温度均为(0±1)℃。每20d取样一次，进行各项指标的测定。每次取样后立即对气调箱进行重新配气。

1.2.2 测试指标及方法

1.2.2.1 非酶促防御系统抗氧化物质含量的测定还原型谷胱甘肽(GSH)含量参照曹建康等的方法［8］进行测定，标准品为 100μmol/L的 GSH标准液。GSH含量的结果以μmol/g表示。

VC含量的测定参照金黎明等［9］的方法，采用高效液相色谱法进行测定。仪器与色谱条件:LC-20AB型高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器，Shim-pack VP-ODS-C18(5μm，150mm，4.6mm)色谱柱。流动相为0.1%草酸溶液，流速为0.8mL/min，检测波长为244nm，进样量10μL，柱温为室温。

1.2.2.2 酶促防御系统重要的工具酶活性的测定取10g去皮果肉，加0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)于 50mL 0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH=6.4)中，冰浴匀浆，4℃冰冻离心机13000×g离心45min，取上清液备用。

过氧化物酶(POD)活性测定参照Jiang等的方法［10］，以每克果实每分钟在460nm波长条件下吸光值变化1为1个酶活单位，结果以U表示。

过氧化氢酶(CAT)活性测定参照Wang等的方法［11］，以每克果实每分钟在240nm处吸光值变化1为1个酶活单位，结果以U表示。超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定参照Constantine和Stanley的方法［12］。以50%抑制的酶液量(μL)为1个酶活单位，结果以U·g-1·h-1表示。

1.2.2.3 抗性相关酶活性的测定 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定参照Koukol等［13］的方法，以每克果实每分钟在290nm处吸光值变化1为1个酶活单位，结果用U表示。

多酚氧化酶(PPO)活性测定参照Jiang等的方法［10］，以每克果实每分钟在398nm条件下吸光值变化1为1个酶活单位，结果以U表示。

各种酶活性均重复测定3次。

1.2.2.4 呼吸速率、果实硬度、木质素含量和腐烂率测定 呼吸速率的测定:将500g样品放在密闭的干燥器中静置1h，用带有TCD检测器的GC-2010型气相色谱仪测定密闭环境中CO2产生量即为呼吸速率，单位:mL CO2·kg-1·h-1。

果实硬度用英国产TA.XT Plus型质构仪进行测定，选用直径为5mm的P/5型不锈钢探头，测定的速度为1.0mm/s，穿透距离为7mm，第一个峰的峰高即为最大力，用以表示硬度值，结果用g表示。

木质素含量的测定参照王艳颖等的方法［14］并加以修改。取10g果肉组织(去皮)与预冷的40mL体积分数95%乙醇研磨，4℃下10000×g离心10min，沉淀物用体积分数95%乙醇冲洗3次，再用乙醇∶正己烷体积比=1∶2冲洗3次，然后加10mL 2mol/L NaOH中止反应。再加20mL冰醋酸和1mL 7.5mol/L羟胺盐酸，10000×g离心，取上清液0.5mL，用冰醋酸定容至10mL，280nm下测定样品吸光值，结果以OD280nm/g表示。

式中:果实腐烂率(%)=(烂果数/总果数)× 100%。烂果是指果实表面至少有一处发生汁液外漏、严重软化或腐烂现象。

1.2.2.5 有效贮藏期统计 有效贮藏期按照腐烂率高低进行统计，腐烂率为10%以下的贮藏天数即为有效贮藏期。每个处理随机统计100个果实。

1.2.3 统计方法 数据用SPSS软件进行统计分析，采用新复极差法进行方差分析，检验差异显著性。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同气体条件对蓝莓非酶促防御系统抗氧化物质含量的影响

由图1(A)可知，GSH在整个贮藏过程中均呈下降趋势，但与对照相比，另3种浓度的CO2处理均可明显减慢GSH下降的速率，40d和60d时3种浓度CO2处理的GSH均显著高于对照(P＜0.05)，尤其是40d时，10%CO2处理、20%CO2处理和30%CO2处理的GSH分别比对照高10.6%、12.3%和11.2%。

尽管对照的VC含量呈先略微下降后缓慢上升趋势，见图1(B)，但始终低于同期的另3种CO2处理。30%CO2处理的VC含量在40d和60d时显著高于其他处理(P＜0.05)，并在60d时出现了峰值，这可能是受较高浓度的CO2处理所致，大多数情况下，果蔬的VC含量会随着贮藏时间的延长而下降，但当采后果蔬处于胁迫状态下时，VC的含量会增加，不同种类和品种的果蔬在高浓度CO2的气调贮藏条件下其VC含量的变化各不相同，这主要取决于期间CO2的含量、贮藏温度和贮藏时间［15］。

图1 不同气体条件对蓝莓GSH含量(图A)和VC含量(图B)的影响

VC是合成谷胱甘肽的前体之一，它不仅能维持GSH的巯基处于还原状态，而且可以使氧化型谷胱甘肽转变为 GSH，使机体代谢产生的 H2O2被还原［16］。因此，植物中的VC和GSH只有协同作用才能较好地发挥抗氧化作用［16］。本实验中3种浓度的CO2处理均有利于VC和GSH含量的保持，尤其是30%CO2处理在60d时，VC含量呈现了显著上升的趋势，而此时其GSH含量也有所上升，并且30%CO2处理的防腐保鲜效果最好，证明VC和GSH间存在着协同作用。

2.2 不同气体条件对蓝莓酶促防御系统重要的工具酶活性的影响

尽管各处理的POD活性在贮藏过程中均呈上升趋势见图2(A)，但CO2处理能更有效地激发POD活性的上升，整个贮藏过程中3种浓度CO2处理的POD活性始终显著高于对照(P＜0.05)。贮藏结束时(80d)，10%CO2处理、20%CO2处理和30%CO2处理的POD活性分别是采收时的5.2倍、7.4倍和9.2倍。

对照的CAT活性呈先上升后下降趋势见图2 (B)，而CO2处理在贮藏初期却抑制了CAT活性。20d时，3种CO2处理的CAT活性均略微下降，而后迅速上升，40d时达到最大值，其中30%CO2处理最有利于CAT活性的提高和保持，40、60、80d时30% CO2处理的CAT活性显著高于其他处理(P＜0.05)。

整个贮藏过程中30%CO2处理的SOD活性始终呈上升趋势见图2(C)，80d时显著高于另两种CO2处理的。而对照和其他两种CO2处理的SOD活性均呈先上升后下降趋势，40d和60d时对照的SOD活性显著低于3种CO2处理(P＜0.05)的，而20%CO2处理的SOD活性在60d和80d时显著高于10%CO2处理(P＜0.05)的。

图2 不同气体条件对蓝莓POD(图A)、CAT(图B)和SOD(图C)活性的影响

2.3 不同气体条件对蓝莓抗性相关酶活性的影响

PAL活性呈先上升后略有下降趋势见图3(A)，40d和60d时3种浓度的CO2处理的PAL活性显著高于对照(P＜0.05)，其中20%CO2处理最有利于PAL活性的提高，40、60、80d时PAL活性最高，并与其他处理间差异显著(P＜0.05)。

CO2处理加快了PPO活性上升的速率见图3 (B)，整个贮藏过程中3种浓度的CO2处理的PPO活性始终显著高于对照(P＜0.05)，并且在60d时出现PPO的活性高峰，此时30%CO2处理的PPO活性显著高于另外两种CO2处理(P＜0.05)的。

2.4 不同气体条件对蓝莓呼吸速率、果实硬度、木质素含量和腐烂率的影响

与对照相比，另3种浓度的CO2处理均可显著抑制呼吸速率的上升见图4(A)。对照的呼吸速率呈先缓慢上升后急剧上升的趋势，并在贮藏过程中始终显著高于CO2处理(P＜0.05)的，而3种浓度CO2处理的呼吸速率均呈先下降后上升趋势，其中以30%CO2处理的呼吸速率最低，在60、80d时与其他处理的差异达显著性水平(P＜0.05)。

木质素含量在贮藏过程中呈上升趋势见图4 (B)，但与对照相比，CO2处理更有利于木质素含量的提高。40d后30%CO2处理的木质素含量高于其他处理，80d时差异达到显著性水平(P＜0.05)，40d和60d时30%CO2处理的木质素含量分别比对照高11.1%和18.0%。

图3 不同气体条件对蓝莓PAL(图A)和PPO(图B)活性的影响

3种浓度CO2处理的果实硬度呈先上升后略有下降趋势见图4(C)，而对照的果实硬度始终呈下降趋势。整个贮藏过程中对照的果实硬度始终极显著低于3种浓度CO2处理(P＜0.01)。3种浓度CO2处理中以10%CO2处理的果实硬度最低，30%CO2处理的果实硬度在60d时高达178.5g，是对照的2.62倍，并显著高于同期的其他CO2处理(P＜0.05)，80d时30%CO2处理的果实硬度尽管有所下降，但仍显著高于其他处理(P＜0.05)。

与对照相比，三种CO2处理均可显著抑制腐烂的发生见图4(D)，而且CO2浓度越高，抑制腐烂的效果越好。40d时对照的腐烂率为2.1%，而此时另3种CO2处理均未出现腐烂;60d时对照的腐烂率分别为其他3种CO2处理的5.4倍、6.1倍和15.5倍，贮藏结束时(80d)，30%CO2处理的腐烂率仅为3.5%，分别比10%CO2处理和20%CO2处理低65.7%和45.2%。

2.5 不同气体条件对蓝莓有效贮藏期的影响

如图5所示，与对照相比，3种浓度的CO2处理均可显著延长有效贮藏期(P＜0.05)，其中以30% CO2处理最有利于延长有效贮藏期，贮藏期长达95d，是对照的2.1倍并显著高于其他两种浓度的CO2处理(P＜0.05)。

3 结论

图4 不同气体条件对蓝莓呼吸速率(图A)、木质素含量(图B)、果实硬度(图C)和果实腐烂率(图D)的影响

图5 不同气体条件对蓝莓有效贮藏期的影响

蓝莓果实对高浓度CO2有很好的忍耐力，该特性为解决采后极不耐贮藏的蓝莓的贮运保鲜问题带来了希望。Schotsmans等［5］的研究结果表明: 2.5kPaO2+15kPaCO2的气调条件可使兔眼蓝莓的贮藏寿命延长两周以上，并可有效保持果实的硬度、可滴定酸含量以及外观品质。我们之前的研究结果则表明:纯CO2气体冲击处理蓝莓48h或96h能有效控制贮藏期间腐烂的发生，保持较高的果实硬度，诱导POD活性升高并使LOX活性维持在较低水平，从而降低蓝莓果实的呼吸速率，并使有效贮藏期延长10d以上［7］。本实验结果表明:高浓度CO2的箱式气调贮藏不仅没有对蓝莓造成伤害，反而激发了果实自身的防御系统，使POD、CAT、SOD以及PAL和PPO活性得以提高，同时能增加VC含量并减慢GSH下降的速率，从而使呼吸代谢速率减慢，并使有效贮藏期显著延长，尤其是5%O2+30%CO2的气体指标贮藏效果最佳，有效贮藏期长达95d。实验结果再次证明，蓝莓果实对高浓度CO2有极强的耐力，迄今为止没有发现任何一种果蔬能在30%CO2条件下长时间贮藏。

PPO、POD、PAL和木质素不仅在植物的抗病反应中发挥重要作用，而且都参与苯丙烷代谢［17］。PAL催化苯丙烷代谢的初始反应形成肉桂酸，进而形成合成木质素的单体—香豆醇、松柏醇和芥子醇，而POD能催化单体木质素聚合形成木质素，PPO也能催化木质素和其它酚类氧化产物的合成，构成保护性屏蔽，并可通过形成毒性较高的醌类物质直接发挥抗病作用［18］。木质素是细胞壁的组分，作为苯丙烷代谢的终产物，沉积在细胞壁不同部位的木质素含量的增加不仅具有防卫病原微生物入侵的功能，还可增强果实的机械强度，减少机械损伤，而蓝莓果实在贮藏过程中极易受到真菌性病害的侵染发生腐烂或软化现象，木质素含量的增加能减少腐烂和软化的发生。实验中3种浓度的CO2处理都不同程度地使上述3种抗病相关酶的活性和木质素含量增加，并提高了果实硬度，其中以POD上升的幅度最大，POD活性的急剧上升与果实硬度的上升现象在甜樱桃果实的气调贮藏中也出现过［10，19］，这可能是由于气调条件引发POD活性的急剧上升和催化作用所致，POD活性的上升不仅能有效地清除自由基，而且能催化更多的木质素单体形成木质素，从而提高果实的硬度，减少腐烂的发生并延长贮藏期。

总之，高浓度CO2的箱式气调条件用于蓝莓的贮藏保鲜，能启动蓝莓果实自身的防御系统，促进果实自身次生代谢物的合成和积累，诱导果实产生一定的系统获得抗性(systematic acquired risistance，SAR)，从而减慢呼吸代谢速率，提高贮藏效果，因此具有很好的应用前景。

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Effects of plastic box modified atmosphere storage on the physiological and biochemical changes of postharvest blueberry fruits

MENG Xian-jun1，JIANG Ai-li1，2，HU Wen-zhong2，TIAN Mi-xia1，LIU Cheng-hui2
(1.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China; (2.Key Laboratory of Biochemical Engineering，The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education，College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

In order to determine effects of plastic box modified atmosphere storage on the physiological and biochemical characters of blueberry fruits，the condition of 5%O2+10%CO2，5%O2+20%CO2and 5%O2+30% CO2atmosphere at 1℃ were established.Meanwhile，the activity of enzymatic defense system and disease resistance-related enzymes，the concentration of non-enzyme antioxidants as well as respiration rate，lignin content，fruit firmness and rot rat were measured every 20 days.The results indicated that compared with CK，three kinds of plastic box modified atmosphere with high CO2stimulated the defense system.Therefore，not only the activities of peroxidase(POD)，catalase(CAT)，superoxide dismutase(SOD)，phenylalanine ammoniacalyase (PAL)and polyphenol oxidas(PPO)were increased，but also VCand reduced glutathione(GSH)contents were kept in a higher level.Moreover，the plastic box modified atmosphere storage with high CO2effectively slowed down the respiration rate，inhibited the occurrence of decay，the lignin content and fruit firmness increased，especially 5% O2+30%CO2was more conducive to delay the senescence process and effectively extending the storage period to 95 days.It was suggested that blueberry fruits had a strong endurance to high CO2and the plastic box modified atmosphere storage with high CO2was perfect at blueberry fruits storage.

plastic box modified atmosphere storage;blueberry fruits;high concentration of carbon dioxide; physiological and biochemical changes

TS255.3

A

1002-0306(2011)09-0379-05

蓝莓(Vaccinium spp)鲜果贮藏方面的研究报道较少，目前已有的研究包括高氧处理［1-2］、高压静电场处理［3］、生物可降解包装材料处理［4］和高CO2气调贮藏［5］等多集中在蓝莓的保鲜技术和保鲜效果的研究和应用上，对蓝莓采后衰老生理生化变化的机制研究还无人问津，更无人对蓝莓进行系统的箱式气调研究。箱式气调贮藏具有周转灵活、携带方便、操作简单等特点，逐渐被应用于果蔬贮藏保鲜及物流中［6］。由于相关的蓝莓气调保鲜研究均表明，蓝莓对高浓度CO2具有极强的忍耐力［5，7-8］，因此本实验系统研究了5%O2+10%CO2，5%O2+20%CO2和5% O2+30%CO2的箱式气调环境下蓝莓的生理生化变化，旨在探索蓝莓忍耐高浓度CO2的程度和机理，为蓝莓气调保鲜提供新的依据。

2011-05-11

孟宪军(1960-)，男，教授，研究方向:食品制造与保藏。

辽宁省科技厅科技攻关项目(2008205001);中央高校基本科研业务专项基金项目(DC10020107)。