油茶果壳鞣质提取工艺及降血糖功能研究

戴甜甜，沈建福

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029)

油茶果壳鞣质提取工艺及降血糖功能研究

戴甜甜，沈建福*

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029)

目的:研究油茶果壳鞣质的提取工艺及降血糖功能。方法:以紫外分光光度法测定含量，采用正交设计实验优化油茶果壳中鞣质的提取工艺。油茶果壳鞣质制备后，以400mg/(kg·d)的剂量灌胃。结果:确定优化工艺为:超声辅助提取80min，固液比1∶20，乙醇浓度50%，油茶果壳中鞣质含量为6.75%。油茶果壳鞣质可明显降低糖尿病小鼠空腹血糖。结论:优化工艺条件可以有效提取油茶果壳中的鞣质，工艺操作简单合理。油茶果壳鞣质是潜在的降糖功能因子。

油茶果壳，鞣质，提取工艺，降血糖

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶果壳 品种为普通白花油茶，取自浙江省常山县芳村镇;没食子酸对照品、钨酸钠 AR，国药集团化学试剂有限公司;钼酸钠 AR，合肥科华精细化工研究所;硫酸锂 99%，上海山海工学团实验工厂;无水碳酸钠 AR，太仓美达试剂有限公司;干酪素 杭州微生物试剂有限公司;磷酸 ≥85%，国药集团化学试剂有限公司;盐酸 AR，兰溪市六洞山化工试剂厂;无水乙醇 AR，国药集团化学试剂有限公司;实验室用水 均为蒸馏水;ICR小鼠 60只，雄性，由浙江大学实验动物中心提供，动物质量合格证号:SCXK(浙)2007-0029;阿卡波糖 规格50mg/片，批号:091023，拜耳医药保健有限公司;葡萄糖测定试剂盒 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法，批号20091216，上海荣盛生物药业有限公司。

5424离心机 德国 Eppendorf股份公司; Varioskan Flash酶标仪 Thermo公司;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;RE-52AAA旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司;SHB-ⅢA循环水式多用真空泵 上海豫康科教仪器设备有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;BS124S万分之一天平 Sartorius公司; KQ-300DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;电动粉碎机 温岭市大德中药机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油茶果壳鞣质提取的步骤 油茶果壳→晒干→粉碎→溶剂浸泡→超声波辅助提取→抽滤→定容→定量分析

1.2.2 鞣质含量测定［11-12］

1.2.2.1 溶液的制备 磷钼钨酸试液:取钨酸钠100g和钼酸钠25g，加水700mL使之溶解，加盐酸100mL和磷酸50mL，加热回流10h，加硫酸锂150g，水50mL和溴数滴，煮沸除去过多的溴(溶液由棕红色渐变为黄色)，放冷，加水稀释至1000mL，过滤。

29%碳酸钠试液:准确称取145g碳酸钠，加蒸馏水定容至500mL容量瓶中。

对照品溶液:精密称取没食子酸对照品50mg，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5mL，置于50mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得0.05mg/mL的没食子酸标准溶液。

1.2.2.2 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于25mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1mL，再分别加入水11.5、11.0、10.5、10.0、9.0、8.0、7.0mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应的试剂为空白，采用紫外分光光度法在760nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为Y=102.17X-0.1199，R2=0.9997(n=6)，在0.01～0.001mg/mL范围线性关系良好。

1.2.2.3 供试品溶液制备 准确称取油茶果壳粉10.0g于250mL三角烧瓶中，按料液比加入一定量的乙醇，采用超声波辅助萃取不同时间后，趁热减压抽滤，用相应浓度的乙醇溶液定容至250mL容量瓶中，作为供试品溶液。

1.2.2.4 样品含量测定 总酚量:精密吸取供试品溶液20mL，至100mL棕色容量瓶中，得待测液。精密吸取待测液0.5mL，按照1.2.2.2项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

不被吸附的多酚量:精密量取待测液25mL，加至已盛有干酪素0.6g的100mL具塞锥形瓶中，密塞，至30℃水浴中保温1h，时时振摇。取出，放冷，摇匀，滤过，精密吸取滤液2mL，置25mL棕色量瓶中，按照1.2.2.2项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，加水10mL，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品中没食子酸的量(mg)，计算，即得。

含量计算:鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量

油茶果壳鞣质含量计算公式:

式中:R为油茶果壳鞣质的含量(%)，C为根据没食子酸标准曲线公式计算出的所测样品没食子酸的浓度(mg/mL)，V为样品体积(mL)，K为稀释倍数，W为油茶果壳粉质量(mg)

1.2.3 提取工艺研究 以乙醇为溶剂采用超声波辅助法提取油茶果壳中的鞣质，影响鞣质含量的主要因素包括乙醇浓度、超声提取时间和乙醇用量。为了得到优化的工艺参数，采用L9(33)的正交实验表，在前期单因素实验的基础上确定的实验因素和水平如表1所示。

表1 提取参数正交实验因素水平表

1.2.4 降血糖动物实验

1.2.4.1 油茶果壳鞣质制备 油茶果壳在优化工艺条件下经超声波辅助提取后，喷雾干燥，得到油茶果壳鞣质粗提物(CPT)。

1.2.4.2 糖尿病小鼠实验［13-15］ICR小鼠适应性饲养3d后禁食(不禁水)8h，链尿佐菌素150mg/kg腹腔注射，注射容积0.1mL/10g，7d后禁食12h，剪尾取血测空腹血糖，根据血糖值随机分为3组，分别为模型组、阳性对照组(阿卡波糖300mg/kg)、油茶果壳鞣质粗提物(CPT)组(400mg/kg)，每组动物数6只。每天定时灌胃给药，给药容积0.1mL/10g，连续给药8d后，禁食(不禁水)12h，末次给药1h后剪尾取血，离心分离血清，测空腹血糖。隔日进行糖耐量实验，小鼠禁食(不禁水)12h，末次给药1h后测空腹血糖，再灌胃给予葡萄糖2g/kg，分别于给葡萄糖后0.5、1、2h剪尾取血，离心分离血清，测血糖值。

2 结果与分析

2.1 提取工艺研究结果

超声波提取在天然产物有效成分提取方面有着突出的作用［16］。超声波能有效地打破细胞边界层，使扩散速度增加，提高破碎速度，从而缩短了破碎时间，可显著提高提取率。同时在浸提过程中不发生化学反应，不破坏所提取生物活性物质的相关活性。

实验以油茶果壳鞣质含量为指标，其值越高越好。正交实验结果见表2。由表2对结果进行极差分析可得，各因素的主次顺序为:提取时间＞固液比＞乙醇浓度。优化的工艺条件组合为:A3B2C3，即超声辅助提取80min，乙醇浓度50%，固液比1∶20。经验证实验可知，在这一条件下油茶果壳鞣质的含量可达6.75%±0.04%。

表4 油茶果壳鞣质粗提物(CPT)对链尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影响(s)

表4 油茶果壳鞣质粗提物(CPT)对链尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影响(s)

注:*表示与模型组比较p＜0.05，＊＊表示与模型组比较p＜0.01。

组别 血糖值(mmol/L) 0 30min 1h 2h AUC (mmol/L·min) 抑制率(%) 445.0±237.1 -阿卡波糖 4.62±3.13＊＊ 12.32±4.39* 3.87±3.09 1.65±3.50* 662.3±391.9* 54.17 CPT 11.75±7.07 18.37±7.01 8.27±5.93 6.58±8.模型组 15.64±2.97 19.80±2.30 7.78±2.97 8.89±4.33 1 33 1267.7±761.8 12.27

表2 油茶果壳超声提取工艺参数正交实验方案及结果的极差分析

2.2 降血糖动物实验结果

2.2.1 油茶果壳鞣质粗提物(CPT)对链尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影响 与模型组比较，阳性对照阿卡波糖组与油茶果壳鞣质粗提物(CPT)组空腹血糖值均有明显的降低，并有显著性差异(p＜0.01)，血糖下降百分率分别为65.1%和38.5%，实验结果见表3。

表3 油茶果壳鞣质粗提物(CPT)对链尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影响(s)

表3 油茶果壳鞣质粗提物(CPT)对链尿佐菌素糖尿病小鼠血糖的影响(s)

注:＊＊表示与模型组比较p＜0.01。

组别 血糖值(mmol/L)血糖下降给药前 给药后 百分率(%)模型组26.21±5.41 23.18±4.37 11 19.44±5.55 6.34±3.4465.1 38.5阿卡波糖 ＊＊CPT 19.77±6.34 13.37±3.31＊＊

2.2.2 油茶果壳鞣质粗提物(CPT)对链尿佐菌素糖尿病小鼠糖耐量的影响 与模型组比较，阳性对照阿卡波糖组0、0.5、2h时刻点的血糖值有明显降低，并有显著性差异(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05)，油茶果壳鞣质粗提物(CPT)组的降糖作用不明显。曲线下面积(AUC)，阳性对照阿卡波糖组较模型组有降低，并有显著性差异(p＜0.05)。阳性对照阿卡波糖组与油茶果壳鞣质粗提物(CPT)抑制率分别为54.17%和12.27%，结果见表4。

3 结论

通过对油茶果壳鞣质的超声波辅助提取方法及工艺的研究，在单因素实验的基础上，用正交实验安排实验方案，结果得出以油茶果壳鞣质含量为指标，影响其值高低的各因素按主次顺序依次为:提取时间＞固液比＞乙醇浓度，并且得到了一组优化的工艺参数:超声辅助提取80min，固液比1∶20，乙醇浓度50%。

本实验研究了油茶果壳鞣质粗提物的降血糖作用，初步结果显示:油茶果壳鞣质粗提物能降低链尿佐菌素糖尿病小鼠的血糖值，与模型组相比，有显著性差异。但对葡萄糖糖耐量的作用不明显。分析其原因可能是鞣质的结构较为特殊，其作用特点一方面是通过与消化道内的许多酶作用，特别是对α-葡萄糖苷酶的活性抑制［17］，从而调控了机体对葡萄糖等成分的吸收，起到降低血糖的作用;另一方面可能通过调控体内6-磷酸葡萄糖激酶、蛋白酪氨酸磷酸酯酶、琥珀酸脱氢酶等的活性，加快血液中葡萄糖的利用。油茶果壳鞣质的种类、结构及其降糖的机制有待进一步研究。

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Study on extraction process of tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.and hypoglycemic effect

DAI Tian-tian，SHEN Jian-fu*
(College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:To determine the optimized extracting process of tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.and study its hypoglycemic effect.Method:Ultraviolet spectrophotometry was used for assay，optimized extraction conditions were adopted by using ultrasonic parameters orthogonal tests.The tannin exreacted from the shell of Camellia oleifera Abel.was given to mice at the dose of 400mg/(kg·d)(ig)and the effect on blood glucose was observed.Results:The optimized extraction conditions were 50%ethanol extracting in 20times solution for 80min.The tannin contect in the shell of Camellia oleifero Abel.was 6.75%.The fasting serum glucose in diabetic mice was reduced significantly.Conclusion:The optimized extraction process could extract the tannin from the shell of Camellia oleifera Abel.efficiently and the extraction technology was simple and reasonable.It’s a protential factor for decreasing bloodsugar.

shell of Camellia oleifera Abel.;tannin;extraction technology;hypoglycemic effect

TS201.1

B

1002-0306(2011)09-0255-04

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我国特有的木本油料树种，目前全国种植面积约为400万hm2，主要分布在湖南、江西、广西、浙江、福建、安徽和贵州等地。我国对油茶的利用主要集中在将油茶籽进行榨油，油茶籽粕提取皂素等，而占油茶果总重量近60%的油茶果壳基本被废弃或焚烧处理，造成资源浪费和环境污染。前期报道指出，油茶果壳含有大量的木质素、多缩戊糖、蛋白质和皂素等化学成分［1］，可以用来生产栲胶、糠醛、木糖醇、活性炭等，并且油茶果壳的提取物有很强的抗氧化能力。钮炎星等的研究也表明油茶果皮含有大量的鞣质和皂苷类成分(《中国粮食学会油脂专业分会第十四届学术年会论文选集》)。近年来，鞣质类化合物作为一类新的活性物质，其研究日益受到人们的重视。这主要是由于其具有多方面的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗脂质过氧化［2-7］等作用。鞣质中表现化学及生理活性的主要活性基团是多酚羟基结构及其没食子酰［8］。可水解鞣质的活性依据没食子酰基或HHDP基的数量增多而增强，缩合鞣质则依据缩合程度的提高而增强。约有70%以上的中草药中含有鞣质类化合物。经毒理及药效学研究结果表示，此类化合物具有明显的抗炎、止痛、止血、抗突变等功效，并且具有低毒、安全的特点，因此具有良好的新药开发价值［9］。沈忠明［10］研究了虎杖鞣质对小鼠的降血糖作用，在同等剂量(100mg/(kg·d))条件下，虎杖鞣质可使小鼠血糖降至6.85mmol/L，低于拜糖平(8.32mmol/L)。

2010-09-13 *通讯联系人

戴甜甜(1985-)，女，硕士研究生，研究方向:油茶副产物的加工利用。

国家自然科学基金(30872056)。