富硒红发夫酵母补料分批培养研究

张 超，尹礼国，朱文优，李正国

(1.重庆大学生物工程学院，重庆400044; 2.宜宾学院生命科学与食品工程学院，发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾644000)

富硒红发夫酵母补料分批培养研究

张 超1，2，尹礼国2，朱文优2，李正国1，*

(1.重庆大学生物工程学院，重庆400044; 2.宜宾学院生命科学与食品工程学院，发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾644000)

通过摇床培养实验，研究了红发夫酵母富硒培养的适宜糖浓度和C/N比;通过5L磁力搅拌发酵罐实验，探讨了在第8～32h之间分四次、七次和连续补料分批培养对细胞产量、细胞色素含量和硒含量的影响;结果表明，30.0g/L的葡萄糖浓度、C/N=2.7分别是分批培养时适宜的糖浓度和碳氮比，细胞产量、细胞色素含量和硒含量分别为14.2g/L、589.7、584.2μg/g;与摇床培养相比较，磁力搅拌发酵罐中补料分批培养显著地提高了细胞产量、细胞色素含量和硒含量;在补料培养中，连续补料的结果优于七次补料，七次补料优于四次补料;在10L机械搅拌罐中连续补料培养时，富硒红发夫酵母的细胞产量、色素含量和硒含量分别为26.7、764.3μg/g和1012.5μg/g。。

红发夫酵母，硒，富集，补料培养

1 材料与方法

1.1 材料与设备

红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)，由宜宾学院发酵工程与食品科学研究所提供;保藏培养基(g/L)葡萄糖20.0，蛋白胨10.0，酵母膏5.0，琼脂20.0，pH5.0;液体种子培养基(g/L) 葡萄糖20.0，尿素3.0，蛋白胨 5.0，酵母膏 5.0，磷酸二氢钾 1.0，调pH4.5;摇瓶培养基(g/L) 尿素12.0，酵母膏5.0，磷酸二氢钾1.0，亚硒酸钠10.0mg/L，调pH4.5，葡萄糖量据实验设计添加;基本培养基(g/L) 葡萄糖30.0，尿素11.2(C/N=2.7)，磷酸二氢钾1.0，调pH4.5。

HZQ-QX控温摇床 哈东联电子;磁力搅拌罐GBCS-5A 镇江东方;机械搅拌罐BIOF-2000型上海高机。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化与液体菌种制备

1.2.1.1 菌种活化 按无菌要求制备PDA斜面，用接种针挑取少许红发夫酵母保藏菌种于斜面上，于28℃的培养箱中，培养2～3d，酵母长成红色菌落后，置于冰箱中4℃保藏备用。

1.2.1.2 液体菌种制备 50mL无菌液体活化培养基，接入2～3环斜面菌种，初始pH4.5，28℃，160r/min下摇床培养36h备用。

1.2.1.3 摇床培养 在500mL三角瓶中装入100mL无菌液体实验培养基，接入液体菌种10%，初始pH4.5，28℃，160r/min摇床培养进行到第8h，一次性添加亚硒酸钠10mg/L。

1.2.1.4 磁力搅拌罐培养 将约3.0L基本培养基装入磁力搅拌罐中，121℃灭菌30min，冷却至28℃，接入10%液体菌种，定体积3.0L，初始pH4.5，通气量为1.9vvm，28℃培养，植物油消泡。葡萄糖、尿素、亚硒酸钠溶液分开灭菌后混合均匀，总补料体积500mL。控制总糖浓度60.0g/L，C/N=2.7，总亚硒酸钠用量30.0mg/L。补料按实验设计进行。

1.2.1.5 机械搅拌罐培养 将约6.0L基本培养基装入发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却至28℃，接入10%液体菌种，定体积6.0L，初始糖浓度30.0g/L，pH4.5，28℃培养，通气量为 1.9vvm，控制溶解氧40%［12］，植物油消泡，温度、pH、溶解氧、补料自动控制。葡萄糖、尿素、亚硒酸钠溶液分开灭菌后混合均匀，控制总糖浓度60.0g/L，C/N=2.7，总亚硒酸钠用量30.0mg/L，总补料体积1350mL。补料方式按实验设计进行。

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 生物量的测定 细胞干重测定:取一定体积V(mL)的细胞培养液于4000r/min的转速下离心15min，去清液，再用50℃蒸馏水洗涤2～3次后，再离心，取菌体置于50℃的干燥箱中干燥至恒重，称重W (g);细胞浓度(g/L)=1000W/V。

1.2.2.2 酵母细胞色素的测定 酸热破碎-丙酮提取-分光光度测定法［13］。

1.2.2.3 硒含量的测定 采用催化吸光光度法［14］。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖浓度对富硒红发夫酵母培养的影响

碳元素作为细胞组成和产物的主要成分，在微生物培养中作用重要。为了了解葡萄糖浓度对富硒红发夫酵母培养的影响，探索适宜的初始糖浓度，设计了以摇瓶培养基为基础，在糖浓度分别为20.0、25.0、30.0、35.0、45.0、60.0、75.0g/L的情况下，摇瓶培养72h，分别测定细胞浓度，细胞中色素含量、细胞中硒含量，结果如图1所示。

图1 糖浓度对富硒红发夫酵母培养的影响

从图1中可以看出，糖浓度低于35.0g/L时，随糖浓度的升高，细胞浓度、色素含量、硒含量增加;当糖浓度中30.0g/L时，色素含量、细胞中硒含量达最高。而当糖浓度超过35.0g/L时，随糖浓度的升高，细胞浓度、细胞色素含量、硒含量很快降低。分析原因可能与过高的糖浓度(＞35.0g/L)抑制了红发夫酵母的生理生化活性、影响其对培养基中物质的吸收与利用有关。因此，培养基中葡萄糖浓度过高，不利于富硒红发夫酵母的培养。由质量守恒可知，要想获得高的细胞浓度需要高糖浓度，由于高浓度糖对细胞生长存在限制作用，因此，采用分批培养方式，难以提高培养液中富硒红发夫酵母的密度。在该实验中，虽然糖浓度为35.0g/L时，有最高的细胞浓度值，但由于糖浓度为30.0g/L时，细胞色素含量(551.3μg/g)和硒含量最高(603.9μg/g)，且有比35.0g/L时有更高的细胞得率系数(0.48g细胞/g葡萄糖＞0.44g细胞/g葡萄糖)，因此，在后续实验中选择初始糖浓度为30.0g/L为宜。

2.2 碳氮比对富硒红发夫酵母培养的影响

培养基中营养物的比例，会影响菌体按比例、均匀地吸收营养物，从而影响微生物地生长。培养基中碳氮比(C/N)失调，还会造成环境酸碱度不稳定，影响菌体的生长、产物量及组成［15］。为给高密度培养研究奠定基础，在初始糖浓度为30.0g/L条件下，按C/N=2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.5、4.0添加尿素，富硒摇瓶培养72h，测定细胞浓度、细胞色素量和硒含量，其结果如图2所示。

图2 C/N对富硒红发夫酵母培养的影响

从图2中可以看出，C/N不超过2.7时，细胞浓度基本稳定在14.15g/L左右，细胞硒含量基本稳定在583.5μg/g左右，但细胞色素含量由566.2μg/g增加到601.3μg/g;C/N超过2.7后，细胞浓度、硒含量开始明显降低，而细胞色素含量略有提高。分析原因可能与C/N提高、基质中氮的量降低，不足以满足细胞增殖对氮素的需要，限制了细胞增殖等有关。同时，也由于C、N比例失调，影响了红发夫酵母对基质中硒的吸收与转化，降低了细胞中的硒含量。这表明C/N为2.7是红发夫酵母富硒培养适宜的碳氮组成。

2.3 不同补料方式对富硒红发夫酵母培养的影响

在三个5L磁力搅拌发酵罐中，在适宜的条件下，培养进行到第8h时，分别开始补料，分四次(第8、16、24、32h，125.0mL/次)、七次(第8、12、16、20、24、28、32h，71.4mL/次)、连续(流量为20.8mL/h)补料三种方式，培养72h，测定细胞浓度、色素含量、硒含量，其结果如图3所示。

图3 不同补料方式对富硒红发夫酵母培养的影响

从图3中可以看出，四次、七次和连续补料时细胞浓度分别是22.8、24.8、26.0g/L，细胞色素含量分别为611.7、672.9、756.1μg/g，硒含量分别为 784.3、843.9、1006.4μg/g。通过补料操作，红发夫酵母的细胞浓度、细胞的色素含量、硒含量比摇瓶培养(14.24、589.7、584.2μg/g)时都有了较大的提高。在补料培养中，随补料次数的增加，细胞浓度、色素含量、硒含量增加，连续补料的效果最好，其细胞浓度、细胞的色素含量、硒含量比七次补料分别提高了4.7%、12.4%和19.3%，比四次补料时分别提高了14.2%、23.6%和28.3%。分析原因，可能由于补料的存在，降低了培养基中初始糖和亚硒酸钠的浓度，解除了高浓度糖和硒对红发夫酵母生长的抑制作用。同时，随补料次数的增加，体系中糖浓度、硒浓度等越来越处于较低浓度，使糖和硒对红发夫酵母生长和代谢的影响得以降低，因此，连续补料方式能获得更高的细胞浓度、色素含量、硒含量。

2.4 富硒红发夫酵母在10L机械搅拌罐中的培养情况

在10L机械搅拌罐中，在适宜的条件下，培养进行到第8h时，开始连续补料(流量为56.3mL/h)至第32h，分别在第8、12、16、20、24、28、32、48、72h取样50mL，测定细胞浓度、色素含量、硒含量，结果如图4所示。

从图4中可以看出，在连续补料培养中，红发夫酵母富集硒、色素合成与细胞生长同步进行，在培养进行到36h前，细胞生长速率较高，此阶段细胞的色素合成和硒富集的能力也最强，含量提高最显著;但在培养进行到36h后，细胞浓度达到26.7g/L，而后几乎不再增加，此时细胞色素和硒含量仍有少量增加(它们最高分别可达到色素含量764.3μg/g，硒含量1012.5μg/g)，但其合成与转化的速度比36h前明显降低。分析原因可能与停止补料后限制性因子增多、细胞浓度提高影响了氧的溶解效果等因素有关。

图4 富硒红发夫酵母在10L罐中的培养情况

3 结论

3.1 红发夫酵母富硒培养时，适宜的葡萄糖浓度为30.0g/L，若糖浓度过高，细胞的产量反而降低。

3.2 培养基中碳氮比(C/N)影响红发夫酵母富硒培养，适宜的C/N是2.7∶1，C/N过高，虽然对细胞色素含量影响不大，但对细胞浓度和细胞的硒含量有较大影响，对提高色素总量和富硒红发夫酵母的品质不利。

3.3 补料方式对高密度培养有较大影响，连续补料培养时细胞浓度、色素含量、硒含量较分次补料显著提高。在10L机械搅拌中连续补料培养时连续补料，获得了细胞浓度26.7g/L，色素含量764.3μg/g，硒含量1012.5μg/g的研究结果。

虽然连续补料在一定程度上实现了富硒红发夫酵母高密度培养，提高了细胞中色素含量、硒含量。但在实验过程中发现，由于糖浓度抑制和培养后期溶氧供给困难，一定程度上限制了细胞的进一步增殖和细胞收得率的提高。因此，筛选耐受高糖浓度和亚硒酸钠浓度的红发夫酵母，探索提高培养体系中溶解氧浓度的方法是值得进一步研究的课题。

［1］彭祚全，陈小华，朱和绪，等.活化硒矿粉与农作物补硒［J］.微量元素与健康研究，2009(6):59-62.

［2］姚晓芬.硒对人体健康影响的研究进展［J］.硅谷，2008 (18):17-18.

［3］蒋守群.有机硒在动物营养上的研究与应用［J］.饲料工业，2005，26(20):43-45.

［4］贾洪锋，贺稚非，刘丽娜.富硒酵母的研究进展［J］.四川食品与发酵，2005，41(3):8-12.

［5］张志焱，程秀芳，刘虹，等.高生物量富硒酵母的选育及发酵条件的优化［J］.饲料博览·技术版，2008(8):22-25.

［6］王菊芳，梁世中.红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)生产虾青素进展［J］.生物工程进展，2000，20(5):48-50.

［7］王梦亮，杨依康，郭小青，等.硒化类胡萝卜素抗氧化作用的研究［J］.药物生物质技术，1998，5(2):109.

［8］张超，徐洲，魏琴，等.红发夫酵母富硒特性研究［J］.食品工业科技，2011，32(4):177-179.

［9］范秀英，郭雪娜，傅秀辉，等.高生物量富硒酵母的选育及培养条件初步优化［J］.生物工程学报，2003，19(6):720-724.

［10］李爱芬，刘振乾，徐宁，等.微量元素硒载体酵母发酵的研究［J］.暨南大学学报:自然科学与医学版，2004，25(5): 626-631.

［11］朱晓立，梁世中，邓毛程，等.不同培养方式对红发夫酵母产虾青素的影响［J］.食品科技，2011，36(1):13-17.

［12］朱明军，杜顺堂，王菊芳，等.产虾青素红发夫酵母Phaffia rhodozyma的反应器培养［J］.华南理工大学学报:自然科学版，2005，33(12):25-28.

［13］张超，梁世中.类胡萝卜素产生菌海洋红酵母培养条件优化研究［J］.四川食品发酵，2000(1，2):32-34.

［14］郝素娥，滕冰.硒酵母中硒含量测定方法的研究［J］.理化检验-化学分册，1999，35(4):151-153.

［15］钱铭镛.发酵工程最优化控制［M］.第一版.江苏科学出版社，1998:306-336.

Fed-batch culture of selenium-enriched Phaffia rhodozyma

ZHANG Chao1，2，YIN Li-guo2，ZHU Wen-you2，LI Zheng-guo1，*
(1.College of Bio-engneering，Chongqing University，Chongqing 400044，China; 2.College of Life Science and Food Engineering，Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，Yibin University，Yibin 644000，China)

The optimum sugar concentration of selenium-enriched phaffia rhodozyma culture and the ratio of carbon and nitrogen(C/N)were studied through shaking culture，and with four times，seven times and constant fedbatch cultures between 8～32h，the cell yield，cell pigment content and selenium content were explored through 5L magnetic stirring fermentor experiment.The results showed that the optimum sugar concentration(30g/L)，the ratio of carbon and nitrogen(C/N=2.7)were from the batch culture，and the cell yield，pigment content and selenium content were 14.2g/L，589.7μg/g and 584.2μg/g，respectively;the cell yield，cell pigment content and selenium content were improved significantly with fed-batch culture compared with shaking culture;the result was the best with constant fed-batch among the three different fed-batch cultures;the cell yield，pigment content and selenium content were 26.7g/L、764.3μg/g and 1012.5μg/g respectively with constant fed-batch culture in 10L mechanical stirring fermentor.

Phaffia rhodozyma;selenium;enrich;fed-batch culture

TS201.3

A

1002-0306(2011)09-0220-04

我国有72%的县(市)属于低硒或缺硒区［1］，人体缺硒会引发癌症、心脑血管疾病、糖尿病、肝病、甲状腺激素失衡等疾病［2］，因此，补硒具有重要意义。酵母硒因具有易被动物吸收、体内可贮存、利用性高、毒性小等特点，一度成为人们研究的重点［3-5］。红发夫酵母不仅含有丰富的蛋白质、肝糖，而且还含有天然类胡萝卜素(虾青素)［6］。由于硒与其它微量元素(如锌、铜)、维生素(如胡萝卜素)等协同作用能成几百至几千倍地清除体内代谢废物——自由基［7］，因此，富硒红发夫酵母是营养功能更全面的有机硒补充剂。富硒红发夫酵母摇床培养研究［8］表明，亚硒酸钠添加量和添加时间对细胞浓度、细胞色素含量和硒含量等有明显影响。因此，探索能克服这些影响因素的途径是实现高产率、高浓度培养目标的重要手段。近期关于富硒酵母的研究主要集中在菌种选育和培养工艺方面。范秀英等［9］采用亚硝基胍处理和生物融合等手段获得了硒含量达到2050mg/kg，生物量可达8.2g/L，有机硒含量达到91%以上的结果。李爱芬等［10］在啤酒酵母对数生长期，采用流加方式逐渐加入亚硒酸钠，得到了酵母细胞中硒浓度达1200～1900mg/kg的结果。朱晓立等［11］采用流加培养显著地促进了红发夫酵母细胞生长及虾青素的合成。为了提高细胞浓度、细胞色素含量和硒含量，提高富硒红发夫酵母产品的竞争优势，本实验探索了富硒红发夫酵母分批补料培养工艺。

2011-05-23 *通讯联系人

张超(1966-)，男，研究生，副教授，主要从事生物工程与食品生物技术研究。

四川省科技厅应用基础研究项目(04JY029-102);宜宾市科技局研究项目(200403021)。