NF-κB介导非对称性二甲基精氨酸上调大鼠主动脉诱导型一氧化氮合酶的表达

徐雪晶 杜广胜 洪李峰 贺 莉 马业新

(华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科,湖北武汉 430030)

NF-κB介导非对称性二甲基精氨酸上调大鼠主动脉诱导型一氧化氮合酶的表达

徐雪晶 杜广胜 洪李峰 贺 莉 马业新＊

(华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科,湖北武汉 430030)

目的 探讨非对称性二甲基精氨酸(ADMA)上调大鼠主动脉诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达是否是通过激活NF-κB实现的。方法 Wistar大鼠50只随机分为四组:①对照组(n=10):标准饲料喂养。②H组(n=12):高脂饲料喂养。③A+H组(n=14):予ADMA[0.2mg/kgd]灌胃,高脂饲料喂养。④P+A+H组(n=14):予吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)[40mg/kgd]腹腔注射、ADMA[0.2mg/kgd]灌胃、高脂饲料喂养。对照组、H组予等体积的生理盐水灌胃及腹腔注射、A+H组给予等体积的生理盐水腹腔注射。18周后麻醉大鼠、取主动脉。以实时荧光定量PCR和Westen blotting分别检测iNOS mRNA和蛋白表达,以电泳迁移率变动分析(EMSA)和增强化学发光法(ECL)检测NF-κB活性。结果 ①A+H组iNOS mRNA和蛋白表达量较对照组和 H组增加(P<0.05),P+A+H组较A+H组iNOS mRNA和蛋白表达量降低(P<0.05)。②A+H组NF-κB活性较对照组和 H组显著升高(P<0.05),P+A+H组NF-κB活性较A+H组明显降低(P<0.05)③相关分析:NF-κB活性与iNOS mRNA和蛋白表达量呈正相关(相关系数r分别为0.854、0.876,P<0.05)。结论 ADMA可能通过激活NF-κB途径上调iNOS表达,从而促进动脉粥样硬化的发生发展。

核因子-κB; 非对称性二甲基精氨酸; 诱导型一氧化氮合酶; 动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种多因素疾病,其中高血脂、高血压和糖尿病是最为重要的危险因素,血浆非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)水平在动脉粥样硬化患者及具有动脉粥样硬化危险因素患者体内都明显增高[1-3]。ADMA是内皮源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的竞争性抑制剂,正常低浓度的ADMA不足以抑制NOS活性。当ADMA在血中浓度过高,便会抑制NOS活性,导致NO产生减少,削弱了NO的舒血管及抗动脉粥样硬化效应。ADMA可通过诱发氧化应激[4-6]、诱导多种炎症因子生成[7]、促进平滑肌细胞凋亡[8]而促进动脉粥样硬化的发生发展。ADMA亦可增强巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因和蛋白的表达,促进巨噬细胞转化为泡沫细胞[9]。iNOS基因表达主要在转录水平上进行,其5’端转录调控区含有NF-κB结合位点[10],而 NF-κB是普遍存在于胞浆中的一种应激反应因子,能与多种细胞基因的启动子或增强子κB位点发生特异性结合并启动基因转录。因此,我们提出假设:ADMA可能通过激活 NF-κB而上调iNOS表达。本研究以健康Wistar大鼠为研究对象,分组干预,对比观察ADMA对大鼠主动脉iNOS、NF-κB表达的影响、探讨NF-κB活性与iNOS表达之间的关系。

材料和方法

1 材料 健康雄性Wistar大鼠(SPF级)50只,210.5g±40.6g,购自华中科技大学同济医学院附属同济医院动物实验中心,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶(上海如吉生物科技发展有限公司),ADMA、PDTC(Sigma),TRIzol Rengent(invitrogen公司),SYBR Green real-time PCR Master mix(TOYOBO公司),LightShiftTMChemiluminescentEMSA Kit(PIERCE公司),兔抗 iNOS多克隆抗体(Santa Cruz),SLAN全自动实时荧光定量PCR检测系统(上海宏石医疗科技有限公司),酶标仪(BIO-TEK公司),Quantity One软件(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分组及干预措施 50只健康雄性大鼠随机分为四组,①对照组(n=10):予标准大鼠饲料喂养;②H组根据文献[11]给予高脂饲料,即3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、10%蛋黄粉和71.3%标准大鼠饲料;③A+H 组:ADMA[0.2mg/kgd]灌胃 ,高脂饲料喂养;④P+A+H组:PDTC[40mg/kg/d]腹腔注射、ADMA[0.2mg/kg/d]灌胃 ,高脂饲料喂养。对照组、H组均予等体积生理盐水灌胃及腹腔注射,A+H组予等体积的生理盐水腹腔注射。除对照组外,其余三组在喂养开始时按体重一次性腹腔注射维生素D30.6MIU/kg[11],对照组注射等体积的生理盐水。饲养18周。

2.2 取材 以30%乌拉坦(1.5g/kg)腹腔注射麻醉大鼠,自主动脉根部至髂动脉分支处剥离主动脉全长,去除血管外脂肪,用4℃生理盐水冲洗干净,以滤纸吸去水分,迅速投入液氮中,4h后转入-80℃冰箱保存。

2.3 Real-Time PCR检测iNOS mRNA表达引物均由Invitrogen公司合成。Trizol法提取组织总RNA,测 RNA浓度;按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA;荧光定量 PCR反应。iNOS引物序列:Sense:5’-TCA GCA CAG AGG GCT CAA AC-3’,Antisense:5’-ACA TCG CCA CAA ACA TAA AGG-3’,扩增片段255bp。内参 Actin引物序列:Sense:5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3’,Antisense:5’-TA G GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3’;扩增片段 110bp。反应总体系 25μl:SYBR Green mix 12.5μl、Plus solution 2.5μl、Primer mix 2μl、去离子水 5.5μl、cDNA 2.5μl。反应条件:95℃预变性 2min后,95℃变性15s,57℃退火15s,72℃延伸 45s,共 40次循环,最后于72℃延伸10min。在同一次反应中,各组均设3个平行重复。每个循环后采集荧光生成扩增曲线。反应结束后,设定阈值,软件输出Ct值;根据比较Ct值法公式,获得不同组间基因表达比值,具体公 式 为 :2-ΔΔCt, 其 中 Δ ΔCt = (Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。

2.4 Westen blot检测iNOS蛋白表达 按试剂盒说明书提取组织总蛋白,按BCA法测定蛋白浓度。以每泳道40-50g上样,经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,转膜,1:200一抗4℃孵育过夜,1:3000二抗室温孵育3h,ECL试剂室温孵育2-5min,曝光10s,照相并分析,以Actin蛋白表达为内参照,用iNOS与Actin条带的灰度比表示iNOS蛋白相对表达量。

2.5 电泳迁移率变动分析(EMSA)和增强化学(ECL)检测NF-κB活性:按试剂盒说明书提取细胞核蛋白,Bradford法测定蛋白浓度。生物素标记NF-κB P65亚基单链寡核苷酸探针序列:5’Biotin-…AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C …-3’,3’-…TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G…-Biotin 5’。5-10 g巨噬细胞核蛋白提取物与标记DNA探针在20 l(10×binding buffer、50%glycerol、1%NP-40、1M KCL 、100mM MgCl2、200mM EDTA 、Biotin-DNA 0.2mol/l)反应液、1g/l poly[d(I-C)]中室温放置20min。反应混合物在终浓度为6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上4℃、180V电泳40min,电泳缓冲液用预冷的0.5×TBE。电泳结束后,将凝胶转移至带正电荷的尼龙膜上,在380mA电流强度下作用30min。转膜完成后将膜于紫外灯下30cm处作用20分钟交联,然后进行封闭、抗体孵育、洗脱、平衡后发光。在暗室中曝光2-5min后,显影、定影。Quantity One软件进行分析。

结 果

1 大鼠主动脉iNOS mRNA表达的比较:图1

图1 Real-time PCR检测各级iNOS mRNA的表达Fig.1 The mRNA expression of iNOS detected by realtime PCR.

与对照组比较,A+H组iNOS mRNA表达明显升高(P<0.05);也明显高于 H组(P<0.05);P+H+A组iNOS mRNA较A+H组明显降低,二者相比差异有显著性(P<0.05)。提示ADMA能增强大鼠主动脉iNOS mRNA表达,而NF-κB特异性抑制剂PDTC可明显抑制ADMA的这一效应。

2.2 大鼠主动脉iNOS蛋白表达的比较:图2

与对照组比较,A+H组iNOS蛋白表达量明显增加(P<0.05),也明显高于 H 组(P<0.05);而P+A+H组iNOS蛋白表达量较A+H组明显减弱,差异有显著性(P<0.05)。表明ADMA能促进大鼠主动脉iNOS蛋白表达,而PDTC可明显抑制ADMA的这一作用。

2.3 大鼠主动脉NF-κB活性的比较 图3

A+H 组(9083.87 ±586.36)NF-κB 活性较对照组 (6341.95 ±510.82)和 H 组 (7027.63 ±320.57)明显升高,两组间比较差异均有显著性(P<0.05);P+A+H 组 (4709.13 ±362.40)NF-κB活性较 A+H组明显降低(P<0.05)。提示ADMA可进一步激活NF-κB。

图2 Westen blot检测各组iNOS蛋白表达Fig.2 The protein expression of iNOS detected by westem blom.

图3 EMSA检测各组NF-κB活性Fig. 3 The NF-κB activity detected by EMSA

2.4 相关分析

各组NF-κB活性与iNOS mRNA及蛋白表达量的相关分析显示:NF-κB活性与iNOS mRNA及蛋白表达量均呈显著正相关(r=0.854,0.876;P<0.05)。

讨 论

iNOS为一种钙离子非依赖型诱生型酶,在正常生理状态下表达较低甚或不表达,但在受到各种刺激如外来抗原、细胞因子等诱导活化时,可合成大量NO;iNOS主要通过生成NO而发挥其生物学作用。高水平的NO除具有炎症介质和氧自由基的性质外,NO还能与超氧阴离子产生氧化性很强的自由基-过氧化亚硝酸盐(ONOO-)[12],后者可氧化修饰脂质、损伤血管,促进AS的发生发展及斑块破裂[13]。iNOS表达调控最重要的是在转录水平上的调节,而且在iNOS基因序列的5’端转录调控区含有NF-κB结合位点,NF-κB激活参与iNOS mRNA表达,且为iNOS表达的必需条件[14]。NF-κB是一种具有基因转录多项调控作用的转录因子,广泛存在于各种细胞中。研究发现NF-κB能够促进细胞凋亡、破坏血管内皮细胞层的完整性、促使吞噬脂质的单核巨噬细胞侵入及平滑肌细胞的增值[15,16]迁移,促进脂质斑块的形成。近年来的许多研究表明,参与粥样硬化斑块形成中炎症反应的相关基因多为NF-κB的靶基因,由NF-κB信号通路调控其转录表达。

本研究结果显示:在动脉粥样硬化病变形成过程中,ADMA无论在基因水平还是蛋白水平上均可明显上调大鼠主动脉iNOS表达,同时增强NF-κB活性;但给予在NF-κB特异性抑制剂PDTC预处理后,ADMA增强NF-κB活性及上调iNOS表达这一效应明显被抑制;相关分析进一步显示NF-κB活性与iNOS表达均呈显著正相关。这一实验结果揭示了ADMA上调iNOS表达是由 NF-κB介导的,抑制NF-κB活性可减少iNOS表达,从而减轻动脉粥样硬化病变程度。因此,我们推测在动脉粥样硬化过程中,血浆中升高的ADMA通过激活NF-κB而上调iNOS表达,iNOS表达增加产生大量NO,后者除作为信使分子参与血管壁的炎症反应外,还与超氧阴离子反应生成过氧化亚硝酸盐,后者分解成反应性更强的羟自由基,促进脂质过氧化,从而加速血管损伤和AS病变程度。

因本研究只观察了NF-κB对ADMA诱导大鼠主动脉表达iNOS的影响,未涉及ADMA激活NF-κB后下游其他产物,如 TNF-α是否变化及其对表达iNOS的影响,以及NF-κB上游的抑制蛋白及可能存在更高水平蛋白酶的调节等问题,所以其中的机制及关系仍需深入研究。

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NF-κB mediates upregulation of inducible nitric oxide synthase expression in rat aortas by asymmetric dimethylarginine

Xu Xuejing,Du Guangsheng,Hong Lifeng,He Li,Ma Yexin＊

(Department of Cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,
Huazhong University of Science and Technology,Hubei W uhan430030,China)

Objective To investigate,whether the asymmetric dimethylarginine(ADMA)upregulated expression of iNOS in rat aortas is modulated by nuclear factor kappa B(NF-κB). Methods 50 Wistar rats were randomly divided into 4 groups:①Control group(n=10)fed with standard diet. ②H group(n=12)fed with high fat diet. ③A+H group(n=14)administered intergastrically with ADMA[0.2mg/kgd],and fed with high fat diet. ④P+A+H group(n=14)given interperitoneal injection of pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)[40mg/kgd],administered intergastrically with ADMA[0.2mg/(kgd)],and fed with high fat diet.Both control and H groups were administered intergastrically and injected interperitoneally with the same volume of normal saline.The A+H group was injected interperitoneal,with the same volume of normal saline. 18 weeks later,the rats were anesthetized,and aortas were gathered. The mRNA and protein expressions of iNOS were detected with real time fluorescent quantitative PCR(real-time PCR)and Westen Blotting respectively. The activity of NF-κB was detected with electrophorestic mobility shift assay(EMSA)and enhanced chemiluminescent(ECL)technique. Results ①The mRNA and protein expressions of iNOS in the A+H group were higher than those in control and H groups(P<0.05)decreased in P+A+H group than in the A+H group(P<0.05). ②The NF-κB activity in the A+H group was extremely higher than in control and H groups(P<0.05);significantly lower in the P+A+H group than in the A+H group(P<0.05). ③ The activity of NF-κB was positively correlated with the mRNA and protein expression of iNOS(P<0.05). Conclusion ADMA upregulates the iNOS expression through the NF-κB activity pathway in rat aortas,which might be one of the mechanisms of atherosclerosis.

Nuclear factor-κB; Asymmetric dimethylarginine; Inducible nitric oxide synthase;Atherosclerosis

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.015

2010-07-10

2010-12-01

徐雪晶,女(1979年),汉族,博士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)