COX-2 和 P-STA T3、P-STA T5在肝癌细胞株SMMC-7721中的表达及意义

2011-11-02赵军艳郑艳敏

中国组织化学与细胞化学杂志 2011年2期

关键词：塞来信号转导细胞株

赵军艳郑艳敏李轩

(武警医学院附属医院消化内科,天津 300162)

COX-2 和 P-STA T3、P-STA T5在肝癌细胞株SMMC-7721中的表达及意义

赵军艳＊郑艳敏李轩

(武警医学院附属医院消化内科,天津 300162)

目的观察COX-2和P-STAT3、P-STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达及其相互关系,探讨环氧合酶2表达与JAK/STAT信号转导通路之间的关系。方法培养人肝癌SMMC-7721细胞,应用免疫组化法检测COX-2抑制剂塞来昔布处理人肝癌细胞株SMMC-7721前后COX-2、P-STAT3、P-STAT5表达的变化。结果 COX-2、P-STAT3、P-STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721均呈高表达,并且COX-2与P-STAT3、P-STAT5的表达呈显著正相关;应用COX-2抑制剂塞来昔布后COX-2、P-STAT3、P-STAT5的表达均显著降低,用药前后相比差异有显著性(P<0.01);但用药后 COX-2与 PSTAT3、P-STAT5的表达无显著相关性。结论 COX-2和JAK/STAT通路有密切联系,抑制COX-2的过度表达可能影响JAK/STAT细胞信号转导通路的活性。

环氧合酶-2; 塞来昔布; 肝细胞癌; P-STAT3; P-STAT5

COX-2与恶性肿瘤尤其是消化系统肿瘤关系密切,选择性COX-2抑制剂塞来昔布已成为预防家族性腺瘤性息肉病的临床药物。COX-2与肝癌发生发展有密切联系,研究认为[1]COX-2的过表达可能参与高分化肝细胞癌的致癌过程,在肝细胞癌发生的早期阶段起重要作用。细胞信号通路在肿瘤发生发展过程中起重要作用,JA K/STA T通路与肿瘤发生关系密切[2],在肝癌发生发展过程中起重要作用,影响肝癌细胞的增殖、分化和凋亡。目前关于COX-2与JA K/STAT通路之间的联系尚无系统研究,本研究探讨两者在肝癌细胞的异常表达及其相互联系,为寻求原发性肝癌新的治疗思路提供理论基础。

材料和方法

1. 材料

人肝细胞癌细胞株SMMC-7721购自中国医学科学院基础医学研究所。环氧合酶-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)为美国辉瑞(pifzer)公司产品,用二甲基亚砜(DMSO)配成10-2mol/L的储存液(DMSO终浓度控制在<1‰),避光、-20℃保存。

2.细胞培养

细胞培养细胞在含10%热灭活小牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的 RPMI1640培养液中,于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,细胞初始浓度为5×105/ml,指数生长期细胞进行实验。

3.主要试剂

兔抗人 COX-2、P-STAT3、P-STAT5多克隆抗体,生物素标记的羊抗兔IgG均购自北京中杉生物试剂公司,SP法免疫组化试剂盒,以及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

4.方法及结果判断

将SMMC-7721细胞以5×104/ml浓度接种于6孔板中灭菌盖玻片(15mm×10mm)上,常规培养1d天后,用COX-2抑制剂刺激细胞,对照组不加刺激因素,培养24h后,取出盖玻片,用新鲜配制的预冷固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)-20℃固定10 min。参照免疫细胞化学试剂盒说明,分别滴加50μl一抗(兔抗人 COX-2,P-STAT3,或 P-STA T5IgG,按 1∶100稀释),4℃保湿过夜;滴加50μl二抗(生物素标记的羊抗兔IgG,按1∶100稀释)。中止反应后苏木素复染,1%盐酸酒精分色,1%氨水反兰,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。以一抗稀释液代替一抗作阴性对照。用Motic Med 6.0医学图像彩色分析系统进行图像半定量分析,每张图片随机选取阳性细胞密集的5个视野,测定肝癌细胞中COX-2、P-STAT3、P-STAT5的棕黄色阳性表达颗粒的平均光密度值。

5.统计学方法

统计学采用 SPSS12.5统计软件分析处理,各项指标均采用均数±标准差(±s)表示,同一指标的两组间比较采用t检验,检验水准取α=0.05;各指标间的关系计数资料采用列联表相关性检验,计量资料采用直线相关分析。

结果

1.COX-2、P-STAT3、P-STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达

COX-2在SMMC-7721细胞中表达为细胞浆呈棕黄色或含棕黄色颗粒(见图1,2);P-STAT3、PSTAT5在SMMC-7721细胞中表达为细胞浆或细胞核呈棕黄色或含棕黄色颗粒(见图3-6);应用COX-2抑制剂塞来昔布后 COX-2、P-STA T3、P-STA T5在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达平均光密度值显著低于用药前(P<0.01)(见表1)。

2.COX-2与 P-STAT3、P-STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721中表达的相关性

表1 应用塞来昔布前后COX-2,P-STAT3和P-STAT5在人肝癌细胞株 SMMC-7721中的表达(±s)Table 1 Expression of COX-2,P-STAT3and P-STAT5in SMMC-7721 cells

＊＊(vs control,P<0.01)

Control 100μmol/L Celecoxib COX-2 0.225 ±0.063 0.046 ±0.024＊＊P-STAT3 0.248 ±0.079 0.165 ±0.045＊＊P-STAT5 0.237 ±0.066 0.156 ±0.052＊＊

表2 应用塞来昔布前人肝癌细胞株SMMC-7721中COX-2和 P-STA T3和 P-STA T5表达的相关性(r值)Table 2 The correlation of COX-2 and PSTAT3,P-STAT5 in SMMC-7721 cells(r value)

表3 应用塞来昔布后COX-2和P-STAT3和P-STAT5表达的相关性(r值)Table 3 The correlation of COX-2 and PSTAT3,P-STAT5 treated with 100μmol/L Celecoxib(r value)

对COX-2与 P-STAT3、P-STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721中表达各指标间进行相关性分析,结果显示,用药前 COX-2与 P-STAT3、PSTAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721中表达呈显著正相关 ,P-STA T3(r=0.635,P<0.01),P-STAT5(r=0.703,P<0.01);用药后 P-STAT3与 PSTAT5表达呈显著正相关(r=0.654,P<0.01),而COX-2与 P-STAT3、P-STAT5表达无显著相关性(见表 2,3)。

讨论

COX是前列腺素(PG)合成过程中的重要限速酶,可将花生四烯酸转变为各种内源性前列腺产物,维持机体各种生理病理过程。有两种同工酶,即COX-1和 COX-2,COX-1定位于内质网,在大多数组织和细胞中稳定表达,有多种生理功能。而COX-2定位于核膜和内质网,一般只在受刺激时迅速合成,静息时并不表达。细胞受各种刺激后经过一系列的信号转导促进COX-2的转录,COX-2不仅是启动炎症反应的关键酶,而且与恶性肿瘤密切相关。

目前研究证实COX-2在多种肿瘤组织及细胞中过表达,已成为肿瘤诊断及治疗的一个新靶点[3]。细胞内外许多因素通过不同信号转导通路影响C0X-2表达[4]。COX-2与肝硬化、肝癌的发生发展关系密切,其在肝硬化、肝癌患者肝组织中的表达均高于正常肝组织[5]。COX-2抑制剂(塞来昔布)可明显抑制肝纤维化和癌前病变的发展[6,7],对肝癌细胞株有明显的诱导凋亡和抑制增殖的效应[8]。目前,塞来昔布已应用于临床抗癌痛治疗,且已被批准用于家族性腺瘤息肉患者的治疗,塞来昔布在临床上预防结肠癌也取得一定成绩。

随着对COX-2基因在肿瘤发展中作用机制的不断研究,目前认为其作用机制可能为增加细胞增殖,抗凋亡[9];促进肿瘤血管生成[10];调节细胞粘附性,增加肿瘤细胞侵袭性[11];产生前列腺素 E2,破坏机体免疫监视功能[12]等。COX-2抑制剂除了可以抑制COX-2以上作用外,还可产生一些不依赖于COX-2的作用[13,14]。大量研究证实COX-2抑制剂可抑制胃癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞增殖,但其抗癌机制及疗效尚缺乏更深入的研究。

JA Ks(Janus kinases)是一类重要的酪氨酸蛋白激酶,细胞因子与受体结合后激活JA K,进而激活“信号转录子和转录激活子”(signal transducer and activator of transcription,STA T)。近年来发现JA K/STAT途径的激活,影响细胞的生长、增殖和转化,此通路与原发性肝癌关系密切。关于COX-2与JA K/STAT通路之间联系目前鲜有报道,因此研究COX-2与 P-STAT3、P-STAT5在人肝癌细胞株SMMC-7721中的表达关系及其应用选择性COX-2抑制剂后三者表达变化,有利于为原发性肝癌的临床治疗开拓新思路。

免疫组织化学结果表明,COX-2与 P-STAT3、P-STAT5在肝癌细胞中均有强阳性表达,COX-2多表达于细胞浆,P-STAT3、P-STAT5在细胞核和细胞浆中均有表达,以细胞核表达为主。COX-2一般只在细胞受刺激时合成,定位于核膜和内质网;STAT3和STAT5属于胞浆蛋白,其活化形式是磷酸化后形成同源或异源二聚体,转位入细胞核内。STAT3和STAT5的过度活化与细胞异常增殖有密切联系,是肝癌细胞信号转导重要途径。本研究发现P-STAT3、P-STAT5在肝癌细胞核和细胞浆中均有表达,以细胞核表达为主。COX-2与 P-STAT3、P-STAT5在肝癌细胞中均有过表达,且三者之间存在显著相关性,表明COX-2和JA K/STAT通路异常激活可能与肝癌的发生发展有关。已有研究发现COX-2的过表达可能参与肝癌的致癌过程,COX-2可能在肝癌发生的早期阶段起重要作用[1]。结合本研究结果,提示COX-2与JA K/STAT途径相互联系共同参与肝癌发生发展过程。

已有研究表明COX-2抑制剂能够诱导肝癌细胞凋亡[15],我们通过检测 COX-2与JA K/STAT通路中重要信号分子P-STAT3、P-STA T5在肝癌细胞中的表达,发现肝癌细胞中存在信号转导系统紊乱。COX-2过表达和JA K/STAT通路过度活化呈显著正相关。应用COX-2抑制剂后COX-2表达显著下降,P-STAT3、P-STAT5表达也较前明显减弱,说明COX-2抑制剂不仅通过直接抑制COX-2的过表达起到抑制肝癌细胞增殖、促凋亡作用,还通过不依赖COX-2途径与肝癌细胞信号转导通路尤其是JA K/STAT通路之间相互作用,抑制此通路过度活化,从不同方面起到抑制细胞异常增殖及抗肿瘤作用。由此可见,进一步深入研究COX-2抑制剂及其与JA K/STAT通路关系,有望在肝癌的靶向治疗及化学预防方面开辟新途径。

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图版说明

图1 COX-2在肝癌7721细胞中的阳性表达。(×400)

图2 应用100μmol/L塞莱昔布24小时后COX-2在肝癌7721细胞中的阳性表达。(×400)

图3 P-STAT3在肝癌7721细胞中的阳性表达。(×400)

图4 应用100μmol/L塞莱昔布24小时后P-STAT3在肝癌7721细胞中的阳性表达。(×400)

图5 P-STAT5在肝癌7721细胞中的阳性表达。(×400)

图6 应用100μmol/L塞莱昔布24小时后P-STAT5在肝癌7721细胞中的阳性表达。(×400)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of COX-2 in 7721 cells.(×400)

Fig.2 Expression of COX-2 in 7721 cells treated with 100μmol/L Celecoxib 24h.(×400)

Fig.3 Expression of P-STAT3in 7721 cells.(×400)

Fig.4 Expression of P-STAT3in 7721 cells treated with 100μmol/L Celecoxib 24h.(×400)

Fig.5 Expression of P-STAT5in 7721 cells.(×400)

Fig.6 Expression of P-STAT5in 7721 cells treated with 100μmol/L Celecoxib 24h.(×400)

The expression and significance of COX-2,P-STAT3and P-STAT5in hepatoma cells

Zhao Junyan＊,Zheng Yanmin,Li Xuan

(Department of Gastroenterology,A f f iliated Hospital of the Medical College of Chinese People’s A rmed Police Force,Tianjin300162,China)

Objective To study the expression and correlation of COX-2,P-STAT3and P-STAT5in hepatoma cells,and to observe the correlation between COX2 and JA K/STAT signaling pathway.Methods The changes of COX-2,P-STAT3and P-STAT5expressions were investigated with immunocytochemistry.Results The expressions of COX-2,P-STA T3,and P-STA T5in HCC were highly,and there were significantly positive correlations of COX2 with P-STA T3and P-STAT5.The expressions of COX2,PSTAT3and P-STAT5were significantly lower after treatment with COX2 inhibitor celecoxib(P<0.01),but there were no significant correalations between COX2 and P-STAT3or P-STA T5.Conclusion There is a significant relationship between COX2 and the JA K/STAT pathway,and the inhibition of the over-expression of COX-2 may have an effect on the activation of the JA K/STAT signaling transduction pathway in hepatoma cells.

COX-2; Celecoxib; Hepatoma cells; P-STAT3; P-STAT5