TP、VEGF在结直肠癌中的表达及临床病理研究

夏传生 李娜萍吴纯东 王义松 王书刚

(解放军第457医院三病区,武汉 430012;1华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所,武汉 430030;2解放军95825部队卫生队,湖北孝感 432111)

TP、VEGF在结直肠癌中的表达及临床病理研究

夏传生 李娜萍1＊吴纯东 王义松 王书刚2

(解放军第457医院三病区,武汉 430012;1华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所,武汉 430030;2解放军95825部队卫生队,湖北孝感 432111)

目的 探讨胸苷磷酸化酶(TP)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达及其与结直肠癌临床病理特征的关系。方法 应用免疫组织化学 EnVisionTM法检测88例结直肠癌组织中 TP、VEGF的表达,结合临床病理特征进行分析。结果 正常结直肠黏膜上皮不表达 TP和VEGF;TP表达于结直肠癌细胞和(或)间质内单个核细胞,VEGF表达于癌细胞。TP和VEGF的阳性表达率分别为42.05%(37/88)和23.86%(21/88)。TP和VEGF在淋巴结转移及Duke’sⅢ-Ⅳ期患者中的阳性率高于无淋巴结转移及Duke’sⅠ-Ⅱ期患者(P<0.05);TP阳性表达率在癌组织浸润至浆膜及浆膜外组高于浸润程度较浅组(P<0.05)。结论 TP和VEGF的异常表达可能促进结直肠癌的浸润与转移。

结直肠癌; TP; VEGF; 预后

血管形成是实体肿瘤得以生存、发展、转移的关键。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是研究较早且较为深入的一种促血管生长因子。新近的研究表明,胸苷磷酸化酶(tyymidine phosphorylase,TP)在结构和功能上与血小板源性内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PD-ECGF)一致 ,具有促进血管生成的作用,在多种人类肿瘤组织中均有其表达水平增高,并与肿瘤的生物学行为及预后相关[1,2]。联合分析 TP和VEGF的表达情况对于判断一些恶性肿瘤的转移和预后有一定意义。

结直肠癌是我国常见的消化道肿瘤,氟尿嘧啶类药物是其辅助化疗的基础用药。近年来的研究发现TP可以催化此类药物在体内代谢活化生成有抗癌活性的终产物[3]。本研究应用免疫组化法联合检测结直肠癌组织中TP和VEGF这两种血管生成诱导剂的表达,分析它们与结直肠癌临床病理特征的关系,旨在初步探讨 TP、VEGF对结直肠癌发生发展的可能影响,同时为临床选择结直肠癌的个性化治疗及估计患者预后提供实验依据。

材料和方法

1. 材料

收集华中科技大学同济医学院附属同济医院和解放军第457医院胃肠外科2010年1月至2010年10月间经手术切除,并经病理诊断证实的原发性结直肠癌标本88例。其中男50例,女38例;年龄18-82 岁 ,平均年龄 55.3 岁;按 Duke’s临床分期:Ⅰ-Ⅱ期43例,Ⅲ-Ⅳ期45例;伴淋巴结转移43例。以30例手术切除结直肠癌标本切缘正常结肠黏膜组织作为对照。患者临床资料完整,术前未行任何放、化疗。

2.主要试剂

VEGF(鼠抗人单克隆抗体,VG-1,即用型)购于福州迈新生物技术开发有限公司;TP(鼠抗人单克隆抗体,P-GP,44C,工作浓度1∶50)、通用型二步法检测试剂盒(PV-6000)和DAB显色试剂盒(ZLI-9018)均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

3.检测方法

免疫组化 EnVisionTM二步法:组织标本经10%中性甲醛固定,石蜡包埋,连续4μm切片,常规脱蜡至水;高压修复中火1min30s,流水冲洗冷却至室温,蒸馏水洗涤3次;3%H2O2避光灭活15min,PBS洗涤3次;一抗孵育1h,PBS洗涤3次;二抗孵育30min,PBS洗涤3次;DAB避光显色3-5min,流水冲洗终止显色;苏木素复染1min,1%盐酸酒精分化5秒,依次脱水透明后中性树胶封固。以 PBS代替一抗作为阴性对照。

4.结果判断

TP表达于结直肠癌癌细胞、癌组织间质内单个核细胞的胞质和/或胞核;VEGF表达于癌细胞胞质内,呈棕黄色或棕褐色着色。Olympus光学显微镜下对切片进行观察并计数阳性细胞。每张切片在10×40倍视野下随机选取4个视野,每个视野计数200个细胞,计算平均阳性细胞率。TP阳性结果判断:>5%中到强着色或>50%弱着色判为癌细胞阳性;癌细胞间质单个核细胞数>50%强着色判为间质细胞阳性[4]。VEGF阳性结果判断参照Bot[5]等的方法,以阳性细胞数≥10%为阳性。

5.统计学方法

采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计学分析,全部计数资料均采用卡方检验,以 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.TP的表达

TP在结直肠癌组织中的总体阳性表达率为42.05%(37/88),其阳性表达部位为癌细胞与间质内单个核细胞的胞质和/或胞核,正常结肠黏膜上皮不表达,差异具统计学意义(P<0.05)(表1,图1)。

2.VEGF的表达

VEGF在正常结肠黏膜不表达,但结直肠癌细胞胞质内可见阳性表达,阳性表达率为 23.86%(21/88),两者差异具显著性(P<0.05)(图 2)。结直肠癌组织中VEGF的阳性表达率低于 TP表达,差异具显著性(表1)。

表1 TP、VEGF在结直肠癌组织中的表达Table 1 The expressions of TP and VEGF in colorectal cancer

3.TP、VEGF表达与各项临床病理参数之间的关系

TP、VEGF阳性表达率与结直肠癌淋巴结转移及Duke’s分期有关,即伴淋巴结转移及Duke’sⅢ-Ⅳ期患者中 TP、VEGF的阳性率高于无淋巴结转移及 Duke’sⅠ-Ⅱ期患者(P<0.05);TP 阳性表达率在癌组织浸润至浆膜及浆膜外组高于浸润程度较轻组(P<0.05)。TP、VEGF阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤分化程度均无关(表2)。

表2 TP、VEGF在结直肠癌中的表达与临床病理特征之间的关系Table 2 The relationship of TP and VEGF expressions with clinical pathological characteristics in colorectal cancer

讨 论

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,随着人们生活方式、饮食结构的改变和寿命的提高,结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。结直肠癌患者确诊时约30%一40%已为中晚期,即使早期病变也有约50%患者发生术后复发、转移。近年来的研究报道,TP在多种人体恶性肿瘤中如乳腺癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌和肝癌等的表达异常增高[6]。结直肠癌组织中TP高表达的患者,组织中新生血管数目增多,容易发生肝转移并且预后不良[7]。TP作为促血管生长因子,是结直肠癌血管形成与维持的重要因子,对结直肠癌的生长、浸润、转移起重要作用。因此,TP作为一个关键的因素而成为近年来研究结直肠癌靶向治疗的主要目标。

TP是胸腺嘧啶核苷合成和分解过程中的关键酶,其主要功能是催化胸腺嘧啶转化为胸苷的可逆性反应,调节体内胸苷水平。人 TP主要来源于血小板,也被称为血小板衍生内皮细胞生长因子,具有刺激内皮细胞生长以促进肿瘤血管生成及抗细胞凋亡的特性,因而可以促进肿瘤的生长和转移[8]。与VEGF等其他生长因子不同,TP不通过受体-配体途径发挥作用,而是通过其酶活性产生相应的产物而发挥促血管生成作用。TP催化胸苷得到的次级产物2-脱氧-D-核糖,在代谢过程中可产生大量的氧自由基,造成局部氧化应激状态并诱导VEGF、IL-8等血管活性因子表达,最终通过各自的作用途径促进血管生成[9]。Tsujitani等的研究表明,TP阳性率与微血管密度(MVD)明显相关,TP阳性的胃癌MVD高于 TP阴性者[10]。抑制 TP的表达可抑制肿瘤的血管生成、肿瘤生长速度及促进肿瘤细胞凋亡[1 1,1 2]。

本研究结果表明:42.05%(37/88)的结直肠癌组织内 TP表达阳性,23.86%(21/88)结直肠癌表达VEGF,而它们在正常结肠黏膜没有或仅有微弱的表达,提示它们对癌细胞来说可能是其代谢或生长所需要的物质。VEGF在肿瘤中的促血管生成作用已使其成为抗肿瘤药物作用的靶点,但在我们的研究结果中其在结直肠癌的阳性表达率明显低于TP的表达,提示结直肠癌组织中的血管生成可能更依赖于TP,TP介导的血管生成可能是更多的结直肠癌进展和转移的重要因素。通过对 TP、VEGF阳性结果与结直肠癌临床病理特征的分析表明,两者表达与患者性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤分化均无明显关系,但与肿瘤的浸润程度、发生淋巴结转移及高的临床分期密切相关,提示高表达 TP和VEGF的肿瘤可能具有更恶的生物学行为。

5 -氟尿嘧啶是胃肠道癌的基础化疗药物。近年来的研究表明,TP可催化抗嘧啶代谢药5-FU与1-磷酸-2-脱氧核糖反应,产生5-氟-2-脱氧尿苷(5-F-2-dUR)参与5-FU在体内的代谢过程,最终生成有抗癌活性的终产物;TP可以将氟尿嘧啶类前体药物转化为5-Fu,当 TP在肿瘤组织内的表达高时,5-Fu的前体药物(如卡培他滨)进入患者体内后在肿瘤组织中更容易转化成5-Fu,这种瘤内激活的治疗方式具有一定靶向性[3,13],因而更为高效低毒。本研究结果表明TP在肿瘤组织内的表达明显高于正常组织,但并非在所有病例均表达,因此,检测癌组织 TP的表达对于临床合理选用化疗药物是必要的。综合目前研究的结果,TP在恶性肿瘤中的表达具有双刃剑作用,一方面其高表达与肿瘤的生长浸润、转移等不良预后因素相关,因此,TP抑制剂将有助于防止肿瘤血管形成和转移;但另一方面 TP又为5-Fu前体药物活化所必需,促进肿瘤组织内 TP表达可以增强氟尿嘧啶类药物的疗效[14]。因此,如何有效地诱导或抑制 TP表达让患者获得最大利益还有待进一步的研究。

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图 版 说 明

图1 TP在结直肠癌及正常结肠黏膜的表达a.TP在结直肠癌细胞的胞质和(或)胞核及间质细胞阳性表达;b.正常结肠黏膜腺体上皮细胞 TP阴性,间质细胞阳性表达。×200;EnVisionTM

图2 VEGF在结直肠癌及正常结肠黏膜的表达 a.VEGF在结直肠癌细胞胞质阳性表达;×400 b.正常结肠黏膜VEGF阴性。×200;EnVisionTM

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of TP in colorectal cancer and normalcolorectal mucosa. A. The positive TP expression in the cancer cells cytoplasm and/or nucleus. B. The negative expression of TP in the normal colorectal mucosa.×200;EnVisionTM

Fig.2 The expression of VEGF in colorectal cancer cells and normal colorectal mucosa. A. The positive VEGF expression in the cancer cells cytoplasm. ×400 B. The negative VEGF expression in the normal colorectal mucosa. ×200;EnVisionTM

The expression of TP,VEGF and its relationship with clinical Pathological significance in Colorectal Cancer

Xia Chuansheng,Li Naping1＊,Wu Chundong,Wang Yishong,Wang Shugang2

Objective To investigate the expression of thymidine phosphorylase(TP)and vascular endothelial growth factor(VEGF)and its relationship with clinical pathological charucteristies of colorectal cancer.Methods Immunohistochemical staining method EnVisionTMwas used to investigate the expression of TP and VEGF in 88 cases of colorectal cancer and its relationship with clinical pathology.Results TP and VEGF were not expressed in normal colorectal mucosa,but TP expression in cancer tissue was observed in both cancer cells and(or)single nucleus cells of the mesenchyme.VEGF expression in cancer tissue was observed in the cancer cells. The positive expression rate of TP and VEGF was 40.05%(37/88)and 23.86%(21/88)respectively in colorectal cancer. Higher in the cases of lymph node metastasis and Duke’s Ⅲ-Ⅳthan in those without lymph node metastasis and Duke’s Ⅰ-Ⅱ(P<0.05). The positive expression rate of TP was higher in the cancer tissue invading the serosa and beyond(P<0.05). Conclusion The anomalous expression of TP and VEGF in colorectal cancer may promote the invasion and metastasis of colorectal cancer.

Colorectal Cancer; TP; VEGF; Prognosis

R734

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.016

2010-12-10

2011-02-03

夏传生,男(1957年),汉族,副主任医师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)

(The Third Dept,NO. 457Hospital ofPeople’s L iberation A rmy,W uhan430012;1Department ofPathology,Tong J i Hospital,Tong J i Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan4300302NO. 95825A rmy S anitation B and ofPeople’s L iberation A rmy,Hubei Xiaogan432111,China)