ERCC-1和RRM-1在NSCLC中的表达及其病理临床意义

李明显 夏传生李娜萍

(华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所武汉 430030;1中国人民解放军第457医院三病区武汉 430012)

ERCC-1和RRM-1在NSCLC中的表达及其病理临床意义

李明显 夏传生1李娜萍＊

(华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所武汉 430030;1中国人民解放军第457医院三病区武汉 430012)

目的 检测核苷酸切除修复(NER)系统的 ERCC-1和RRM-1在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达并分析其表达的病理临床意义,为探索NSCLC的有关发生机制及术后辅助化疗提供有用的实验依据。方法 应用免疫组织化学二步法检测128例NSCLC组织中 ERCC-1和RRM-1的表达,以10例支气管扩张症肺组织作为对照。结果 1.ERCC-1在NSCLC组织中的总体阳性表达率为44.53%(57/128),在对照组肺组织气道上皮的阳性表达率为100%(10/10),ERCC-1在NSCLC组织和对照组的阳性率差异有统计学意义(P<0.05);RRM-1在NSCLC组织中的总体阳性表达率为75%(96/128),在对照组肺组织气道上皮不表达,RRM-1在NSCLC组织和对照组的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。2.ERCC-1的表达与NSCLC患者的年龄、组织学类型及分化程度存在相关性(P<0.05);RRM-1的表达与NSCLC患者的年龄存在相关性(P<0.05)。NSCLC组织中ERCC-1与RRM-1的表达呈正相关(P<0.01)。结论 ERCC-1表达降低或缺失可能与NSCLC发生有关;NSCLC组织中存在着ERCC-1与RRM-1的差异表达,提示不同个体的NSCLC其生物学行为可能不同,因此检测NSCLC组织中NER系统的表达情况对选择NSCLC的个性化辅助化疗及估计患者的预后有指导意义。

错配切除交叉互补修复酶1; 核糖核苷酸还原酶M1; 非小细胞肺癌

近年来,随着吸烟及各种环境因素的影响,肺癌 的发病率和病死率明显上升,位于癌亡男性患者的首位。最新数据表明非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌患者的85%[1],大部分患者发现时已处于晚期,术后的长期存活情况并不理想,即使辅助化疗也没有较好的改善,因此总体5年生存率不到5%。新近研究表明,DNA修复基因修复力低者肺癌发生的风险较正常人明显增加,而修复力高者对化疗药物耐药,使化疗失败。错配切除交叉互补修复酶-1(excision repair crosscompletion1,ERCC-1)是人类核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)系统的一个重要切除修复酶,在DNA修复中起关键作用,其在正常细胞中的表达可以降低细胞突变的几率。核糖核苷酸还原酶M1(ribonucleotide reductase subunit M1,RRM-1)是核苷酸类似物的化疗药物的结合位点。RRM-1基因定位于一个可出现于多种恶性肿瘤的杂合子丢失(LOH)区域。研究表明RRM-1与肿瘤易感性、肿瘤进展及对化疗药物的反应可能有关。本研究通过免疫组化法观察NSCLC组织中是否存在ERCC-1和 RRM-1的表达异常和表达差异,分析其表达的病理临床意义,探讨NSCLC的有关发生机制并为临床医师更多地了解NSCLC患者肿瘤组织的有关信息、选择个性化的辅助化疗及评价患者的预后提供有用的依据。

材料和方法

1. 材料

收集华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科2010年1月至2010年5月经手术切除的非小细胞肺癌组织128例。其中男95例,女33例;年龄37岁-81岁,中位年龄57岁。以10例支气管扩张症肺组织作为对照,其中男 5例,女5例;年龄 17岁-57岁,中位年龄40.5岁。患者临床资料完整,术前未行任何放、化疗且未合并其他肺部原发肿瘤。

2.主要试剂

ERCC-1(鼠抗人单克隆抗体,MAB-0600)购于福州迈新生物技术开发有限公司;RRM-1(兔抗人多克隆抗体,ZA-0373)、通用型二步法检测试剂盒(PV-6000)和DAB显色试剂盒(ZLI-9018)均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

3.检测方法

石蜡组织连续4μm切片,常规脱蜡至水;高压修复中火1min30s,流水冲洗冷却至室温,蒸馏水洗涤3次;3%H2O2避光灭活15min,PBS洗涤3次;一抗孵育1h,PBS洗涤3次;二抗孵育30min,PBS洗涤3次;DAB避光显色3-5min,流水冲洗终止显色;苏木素复染1min,1%盐酸酒精分化5s,依次脱水透明后中性树胶封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。

4.结果判断

ERCC-1表达于NSCLC癌细胞核内,RRM-1表达于NSCLC癌细胞胞质与胞核,DAB显色呈棕黄色或棕褐色颗粒状。光学显微镜下对免疫组织化学染色切片进行观察并计数。每张切片在10×40倍视野下随机选取5个视野,每个视野各计数150-300个肿瘤细胞(若不满足此条件则更换视野),计算阳性细胞率。阳性细胞<10%为0分;10%-25%为1分;26%-50%为2分;51%-75%为3分;>75%为4分。按染色强度计分:无着色为0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。总分为:阳性细胞数分值×染色强度分值[2],将0-2分判为阴性,>2分判为阳性。

5.统计学方法

采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计学分析,性别、年龄、肿瘤大小、组织类型、淋巴结转移及p TNM分期等参数分析应用卡方检验,病理分级应用Spearman等级相关分析,以 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.ERCC-1的表达

免疫组化结果显示,ERCC-1不同程度地表达于NSCLC癌细胞胞核,细胞核呈棕褐色强阳性着色(图1A)及棕黄色弱阳性着色(图 1B)。128例NSCLC中,ERCC-1阳性表达率为 44.53%(57/128)。其阳性表达与NSCLC患者的年龄、组织学类型及分化程度有关,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。ERCC-1在对照组气道上皮呈棕褐色强阳性着色(图1C),阳性率为100%(10/10)。两组间差异有统计学意义(P<0.01)。

2.RRM-1的表达

免疫组化结果显示,RRM-1不同程度地表达于NSCLC癌细胞胞质,细胞质呈棕褐色强阳性着色(图 1D)及棕黄色弱阳性着色(图 1E)。128例NSCLC中,RRM-1阳性表达率为 75.0%(96/128)。其阳性表达与患者的年龄有关,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。RRM-1在对照组气道上皮仅部分呈淡黄色着色(图1F),无阳性表达(0/10)。两组间差异有统计学意义(P<0.05)。

3.ERCC-1与RRM-1表达的相关性

在NSCLC癌细胞中,ERCC-1与 RRM-1的表达呈显著性正相关(r=0.406,P<0.01)(表 2)。

图1 ERCC-1与RRM-1在NSCLC及对照组肺组织中的表达(EnVisionTM二步法)Fig.1 The expression of ERCC-1 and RRM-1 in NSCLC and compare with normal tissuesA:ERCC-1在NSCLC强阳性表达,×400;B:ERCC-1在NSCLC弱阳性表达,×200;C:ERCC-1在对照组肺气道上皮细胞阳性表达,×400;D:RRM-1在NSCLC强阳性表达,×400;E:RRM-1在NSCLC弱阳性表达,×200;F:RRM-1在对照组部分肺气道上皮细胞弱阳性表达,×200A:Strong expression of ERCC-1 protein in NSCLC,×400;B:Weak expression of ERCC-1 protein in NSCLC,×200;C:Positive expression of ERCC-1 protein in the the control group,×400;D:Strong expression of RRM-1 protein in NSCLC,×400;E:Weak expression of RRM-1 protein in NSCLC,×200;F:Weak expression of RRM-1 protein partly in the the control group,×200

表1 ERCC-1和RRM-1在NSCLC中的表达水平与病理临床特征之间的关系T able 1 Relationship of ERCC-1 and RRM-1 expression with clinical pathological characteristics in NSCLC

表2 ERCC-1与RRM-1在NSCLC中表达的相关性Table 2 Relationship between ERCC-1and RRM-1 expression in NSCLC

讨 论

肺癌是全世界癌症中发病率和死亡率最高的疾病。吸烟、空气污染及电离辐射等因素都可不同程度地引起细胞DNA损伤,并促进肺癌的发生。DNA损伤修复系统在维持基因组的完整与稳定、纠正错配复制、避免可导致严重后果的基因突变及防止细胞癌变方面起着非常重要的作用。细胞内的NER系统负责修复紫外线照射诱发的嘧啶二聚体、多环芳香碳氢化合物、氧化损伤以及铂类药物所致的DNA损伤,ERCC-1和RRM-1是NER系统的两个重要成员。

近年来肺癌的耐药性已经成为临床治疗的一个难题。ERCC-1是NER系统的限速酶,被认为是NER系统的先导基因,负责对损伤进行识别和剪切,在DNA单链受损处的5’端进行剪切,并以互补链为模板进行复制的方式来维护基因组的完整性,其功能活性的高低可反映整个NER系统的修复活性[3]。顺铂和卡铂是目前临床上最常用的肺癌化疗药物,铂类药物与肿瘤细胞的DNA结合形成链内和链间的泡状加合物,使DNA复制受到抑制,从而抑制肿瘤细胞的生长。Junichi等[4]认为细胞的DNA损伤修复能力可能是肺癌对铂类耐药的重要因素,而ERCC-1被认为是其中的主要原因。ERCC-1在DNA的修复方面发挥了双刃剑的作用:一方面在正常细胞中的高表达起着稳定细胞DNA、防止其突变的抑癌作用,另方面研究表明其表达水平也可能影响不同发展时期NSCLC患者对铂类药物的敏感性,早期术后患者中 ERCC-1高表达者比低表达者生存期显著延长,另一方面在接受铂类化疗的晚期NSCLC患者中,ERCC-1阳性表达者较阴性者预后差。在基因水平,Chiun等[5]研究发现 ERCC-1 mRNA高表达与顺铂耐药相关,而低表达与化疗疗效增加相关;在蛋白水平,研究发现 ERCC-1低表达者比高表达者更能从化疗中获益,最新研究亦显示ERCC-1阴性表达者提示对吉西他滨敏感;ERCC-1高表达与预后差显著相关[6-8]。Olaussen等[9]报道称 ERCC-1表达与肿瘤大小、TNM分期无相关性,而与年龄、性别、病理类型及有无胸膜血管侵袭显著相关。本研究对照组气道上皮细胞100%阳性表达 ERCC-1,而128例NSCLC中仅57例明显阳性表达,阳性率为44.53%,与文献报道一致,表明ERCC-1表达降低或缺失可能与气道上皮细胞癌变关系密切。在我们的研究结果中,ERCC-1表达与患者年龄、肿瘤分化程度及组织学类型相关,年龄较大者 ERCC-1表达率较高,是否表明高龄患者可能对化疗药敏感性更差。高～中分化的肿瘤较低分化的肿瘤 ERCC-1阳性表达率高,是否可以解释高分化癌对化疗药较不敏感。此外,我们的资料中肺鳞癌较之肺腺癌有更高的 ERCC-1阳性表达率,这与有些报道不一致,可能与观察的病例数不同或患者人群的异质性有关。

核糖核苷酸还原酶M1(ribonucleotide reductase subunit M1,RRM-1)是DNA合成通路中的限速酶,也是细胞存活的关键酶。RR包括2个亚单位:RRM-1和 RRM-2,RRM-1是核苷类似物系的化疗药物的结合位点。RRM-1基因定位于一个可出现于多种恶性肿瘤的杂合子丢失区域,有报道75%的NSCLC患者存在这样的杂合性缺失,没有这种杂合性缺失的患者比存在这种缺失的患者有更好的预后及更长的生存期。体内外实验研究表明RRM-1是吉西他滨疗效的重要细胞决定因子。RRM-1阳性的NSCLC患者应用吉西他滨化疗药物预后差[10]。本组研究观察数据表明NSCLC组织中RRM-1的表达率较高,且与肿瘤大小、组织学类型、分化程度、淋巴结转移、临床分期等均无关而与患者年龄相关,大于57岁的患者 RRM-1较多表达,这与本组资料中ERCC-1的表达趋势一致。

Ceppi等[11]研究发现在NSCLC中 ERCC-1与RRM-1几乎是同步的,具有相似的临床意义,本文的数据分析也显示了二者在蛋白水平上呈显著正相关。

ERCC-1表达降低或缺失可能与NSCLC发生有关;NSCLC组织中存在着ERCC-1与RRM-1的差异表达,提示不同个体的NSCLC其生物学行为可能不同,因此检测NSCLC组织中NER系统的表达情况对选择NSCLC的个性化辅助化疗及估计患者的预后有指导意义。

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Expression of ERCC-1 and RRM-1 and its relationship with clinical pathological characteristics in non-small cell lung cancer

Li Mingxian, Xia Chuansheng1, Li Naping＊

(Department ofPathology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030;1The Third District,NO.457Hospital of People’s L iberation A rmy,W uhan430012China)

Objective To investigate the expression of ERCC-1 and RRM-1 proteins of the nucleotide excision repair(NER)system in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)and to analyze their correlations with the clinicopathological characteristics,providing a helpful experimental evidence for exploring NSCLC pathogenesis and resistance to chemotherapeutic drugs.Methods Immunohistochemical methods were used to investigate the expression of ERCC-1 and RRM-1 proteins in 128 cases of histopathologically defined NSCLC and 10 cases of bronchiectasis. Results 1. The positive expression rate of ERCC-1 and RRM-1 in NSCLC was 44.53%(57/128)and 75%(96/128),respectively.The different positive rates between NSCLC and control lung tissues had statistical significance. 2. The expression of ERCC-1 was related to age,histological type and tumor grade,but the expression of RRM-1 was related to age in patients with NSCLC. The relationship between ERCC-1 and RRM-1 was positive. Conclusion The reduction or lack of ERCC-1 expression may be significant in the pathogenesis of NSCLC.The expressions of ERCC-1 and RRM-1 were different in some individuals of NSCLC,indicating that the biological behavior may be different in them.It may be of great significance to detect the expression of the NER system in NSCLC for choosing the best adjuvant chemotherapy and estimating individual patient’s prognosis.

ERCC-1; RRM-1; NSCLC

R365

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.007

2010-11-18

2011-02-17

李明显,男(1980年),汉族,硕士。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)