质粒pAAV-HRE-CD151的构建和鉴定

魏 全林敬阳左后娟费宇杰彭 丹黄晓琳＊刘正湘＊

(1华中科技大学同济医学院附属同济医院康复科,武汉 430030;2浙江省人民医院心内科,杭州 310014;3华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科,武汉 430030)

质粒pAAV-HRE-CD151的构建和鉴定

魏 全1林敬阳2左后娟3费宇杰3彭 丹3黄晓琳1＊刘正湘3＊

(1华中科技大学同济医学院附属同济医院康复科,武汉 430030;2浙江省人民医院心内科,杭州 310014;3华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科,武汉 430030)

目的 为了增加CD151基因转染大鼠缺血心肌的效率和靶向特异性。方法 以质粒pAAV-CD151为模板,采用克隆技术,构建一个含缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)和CD151基因序列的腺相关病毒载体,通过 HRE促进CD151在大鼠缺血心肌的表达。结果 经过测序鉴定成功构建了含缺氧反应元件的质粒pAAV-HRE-CD151。结论成功构建了pAAV-HRE-CD151质粒,为CD151治疗缺血性心血管病的靶向研究奠定了基础。

心肌缺血; CD151; HRE; 基因治疗; pAAV-HRE-CD151

促血管生长因子的运用为人类缺血性心血管疾病的治疗研究开辟了一条新的途径。研究显示,CD151基因能促进大鼠缺血后肢的新生血管形成以及能增加大鼠心肌缺血区域微血管数量[1,2]。进一步的研究表明CD151基因能增加小型猪心肌梗死模型中的毛细血管和小动脉密度,从而改善心功能[3,4]。这些观察都充分表明CD151基因能促进缺血心脏的血管形成而用于心肌缺血的基因治疗。

随着基因治疗研究的深入,人们越来越关注基因治疗的安全性和导入方式的重要性。目前基因治疗的导入方式主要包括病变部位直接注射、经导管注射和静脉注射,相对而言,静脉注射是一种创伤性最小的、安全的基因导入方式,容易被临床的病人所接受,但是它难以使外源基因在缺血区域高表达而促进有效的血管形成,如果通过静脉给予大剂量的外源基因,就可能会增加外源性基因对其他脏器所产生的副作用,如血管瘤形成和视网膜病等[5,6]。虽然我们在以前的CD151动物实验中没有观察到这些副作用,但在CD151将来的临床应用中,将这些可能的副作用限制到最小的程度是非常重要的。我们设想通过构建一个含缺氧反应元件和CD151基因序列的腺相关病毒载体静脉导入CD151基因,利用缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)来调节其在缺血区域的表达[7],以期增加CD151在缺血区域的表达而减少外源基因在非缺血部位或器官的表达。

材料和方法

1.材料

1.1 质粒、菌株

含人类全长野生型CD151 DNA的质粒pAAVCD151由本课题组前期构建[8]。该质粒的CD151基因后面带有HA尾并且与 HA尾直接相连。大肠埃希菌 E.Col iDH5α购自美国Invitrogen公司。

1.2 主要试剂

限制性内切酶Mlu I、Kpn I,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自 Fermentas公司;限制性内切酶BamH I、DNA 连接酶、DNA Marker购自 Ta KaRa公司;引物及序列合成购自南京 Genescript公司。

2.方法

2.1 引物设计

按照引物设计原则,采用引物设计软件(Primer Premier 5.0),根据已知的来源于人烯醇化酶(enolase,ENO)的 HRE序列和pAAV-CD151载体中CMV的序列设计2对引物,分别为 F1和 R1,F2和R2。其中 F1是 HRE的上游引物,引入Mlu I限制性内切酶酶切位点,R1是 HRE的下游引物,含有BamH I酶切位点;F2是CMV的上游引物,引入BamH I限制性内切酶酶切位点,R2是CMV的下游引物,含有 Kpn I酶切位点。2对引物序列如下:F1:TCACGCGT AGGGCCGGACGT,R1:TA GGA TCC GGGGCTCCGT; F2 : CA GGATCCGGATCTAATAGTAATCAATTACGG,R2:GTGGTACCGTCGAGGCTAG。其中 F1下划线处为Mlu I限制性内切酶酶切位点,R1、F1下划线处为BamH I酶切位点,R2下划线处为 Kpn I限制性内切酶酶切位点。引物由南京 Genescript公司合成,用去离子水配制成10 mmol/L。

2.2 质粒pAAV-HRE-CD151的构建

根据已知的来源于人烯醇化酶(enolase,ENO)的HRE序列用人工合成的方法加以合成,该序列为:AGGGCCGGACGTGGGGCCCCAGAGCGAC GCTGAGTGCGTGCGGGACTCGGA GTACGTGACGGAGCCCC,用引物 F1、R1对该序列进行PCR扩增,根据高保真聚合酶probest的使用说明配备。将引物 F1和 R1加入 PCR反应体系中,PCR反应条件为:95℃预变性5min,95℃变性30s,59℃退火 30s,72℃延伸 1min,30个循环,得到含Mlu I和BamH I酶切位点的 HRE序列。

用限制性内切酶Mlu I和 Kpn I同时切质粒pAAV-CD151得到含Mlu I头和 Kpn I尾的CMV序列(918bp)和含Mlu I头和 Kpn I尾及CD151基因序列的AAV载体(4029bp),琼脂糖胶电泳分离两片段,紫外灯下分别切下含两序列的胶,用质粒回收试剂盒回收两片段。

以酶切回收的 CMV系列为模板,利用引物F2、R2进行PCR扩增,根据高保真聚合酶probest的使用说明配备。将引物F2和R2加入PCR反应体系中获得含BamH I头和Kpn I尾的CMV序列,PCR反应条件为:95℃预变性5 min,95℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸1 min,30个循环,琼脂糖胶电泳,紫外灯下切下含该序列的胶,用质粒回收试剂盒回收该片段。

用限制性内切酶BamH I对 PCR后回收的HRE片段和CMV片段分别进行单酶切反应,琼脂糖胶电泳,紫外灯下切下含各自序列的胶,质粒回收试剂盒分别回收两片段。

将单酶切后回收的序列 HRE和CMV进行连接反应(16℃恒温水箱过夜),然后以连接产物为模板,以F1:5’-TCACGCGTA GGGCCGGACGT-3’(Mlu I)为上游引物 ,以 R2:5’-GTGGTACC GTCGA GGCTAGC-3’(Kpn I)为下游引物进行 PCR扩增反应,紫外灯下观察,可见750bp-1000bp之间明亮条带,切下含该条带的胶回收,得到含Mlu I头和 Kpn I尾的序列HRE-CMV。

将回收的 HRE-CMV序列用限制性内切酶Mlu I和 Kpn I进行双酶切,酶切后琼脂糖胶电泳回收。后将酶切回收的 HRE-CMV序列(Mlu I头和含 Kpn I)与酶切回收的含Mlu I头和含 Kpn I尾及CD151基因序列的 AAV载体进行连接反应(16℃恒温水箱过夜),得到连接产物pAAV-HRECD151(图 1)。次日将其转化大肠埃希菌 E.ColiDH5α,在固体LB上培养过夜后挑取单克隆摇菌,提取质粒,测序。

图1 质粒pAAV-HRE-CD15的构建示意图Fig.1 The sketch map of construction of plasmid pAAV-HRE-CD151.

结 果

1.载体的制备

用限制性内切酶 Mlu I和 Kpn I切质粒pAAV-CD151得到含Mlu I头和 Kpn I尾的CMV序列(918bp)和含Mlu I头和 Kpn I尾的CD151基因载体(3965bp),在紫外灯下能见到750 bp-1000 bp及3000 bp-5000 bp之间明亮条带(图2),说明酶切及载体制备结果正确。

图2 质粒pAAV-CD151的酶切结果。750 bp-1000 bp之间的条带为CMV序列,3000bp-5000 bp之间的条带为含CD151的载体序列Fig.2 The bands between 750 bp-1000 bp was CMV sequence,The bands between 3000bp-5000bp was contained vector sequence of CD151.

2.PCR定性分析

将序列 HRE和CMV进行连接,以连接产物为模板,以 F1、R2为引物进行 PCR扩增,在紫外灯下观察,可见750bp-1000bp之间后明亮条带(连接产物为996bp)说明 HRE与CMV连接成功(图3)

图3 以 HRE和CMV连接产物为模板的PCR。750bp-1000bp之间条带为PCR扩增产物Fig.3 The bands between 750bp-1000bp was PCR cloning products.

3.pAAV-HRE-CD151质粒测序

将连接产物转化入大肠埃希菌 E.Col i DH5α感受态细菌,挑选阳性单克隆摇菌,提质粒并测序,测序结果表明质粒pAAV-HRE-CD151构建正确(图4)。

图4 质粒pAAV-HRE-CD15的测序结果。231～298之间的序列为 HRE的反向互补序列Fig.4 This sequence was sequence of plasmid pAAVHRE-CD151,The sequence between 231-298 was the sequence of reversed complementary of HRE.

讨 论

冠心病依然是当今世界人群中致病率和病死率的主要原因。目前治疗方法主要包括药物治疗、冠状动脉介入治疗和搭桥术,其治疗目的是通过增加血供以及减少心肌的耗氧量。然而,对于一些弥漫性动脉粥样硬化的病人,介入治疗或搭桥术的机会非常有限。利用促血管生成因子进行治疗性血管生成逐渐成为一种改善心肌缺血的新的治疗方法[9-11]。动物及临床实验已经证明运用促血管生成因子如CD151、成纤维细胞生长因子及血管内皮生长因子等能诱导缺血心肌区域的血管形成而改善心肌缺血和心脏功能[1,9,11]。CD151,为 TM4SF最重要的成员之一,由4个疏水跨膜区、一大一小两个胞外环和两个短的胞内末端组成[12,13]。其高表达于上皮细胞、内皮细胞、血小板、巨核细胞及一些未成熟造血细胞[14,15],在调节体外内皮细胞移动性和血管形成方面扮演重要的角色[16,17]。最新研究表明,CD151基因敲除的大鼠肺内皮细胞血管形成方面的能力如迁移、扩散、浸润、管状和网状结构形成以及新芽形成能力均明显减弱[18]。而利用CD151基因转染人脐静脉内皮细胞能提高细胞在Matrigel基质上的增殖、迁移和毛细管形成能力[19]。我们以前的研究表明CD151基因导入能增加大鼠心肌梗死模型和大鼠后肢缺血模型中缺血区域的微血管数量[1,2]。进一步的研究表明CD151基因导入能促进小型猪心肌梗死模型的血管形成并通过13N-NH3PET成像和超声心动图证实了CD151诱导的新生血管形成能有效地增加心肌灌注以及显著地改善局部心肌功能[3,4]。所有这些观察都充分表明CD151基因可以用于心肌缺血的治疗,促进血管形成。

导入的外源基因进入血循环,是可能在非缺血区分布和表达的,并可能引起不需要的血管生成,没有调控的外源基因表达可能引起肿瘤样血管和血管瘤形成等副作用[5,20]。为了缺血心肌基因治疗的安全性以及限制不受控制的外源基因的表达,理想的调控应该是让CD151基因具有靶向性,即在心肌缺血区高表达,而在非缺血区不表达或低表达。在缺氧条件下,缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)产生或上调,并通过与缺氧反应元件 HRE的结合调节基因的表达,因此 HIF-1α/HRE是一个理想的控制外源基因表达的调控系统。HRE存在于人烯醇化酶、红细胞生成素等基因中,其核心序列是(A/G)CGT(G/C)C,HRE已被用于调节血管内皮生长因子等基因的表达。因此,我们选择将 HRE构建到pAAV-CD151载体中,以增加CD151在心肌缺血区的表达,从而促进新生血管形成,为CD151基因治疗心肌缺血的靶向性研究和将来的临床应用研究奠定基础。

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Construction and Identification of the plasmid pAAV-HRE-CD151

Wei Quan1,Lin Jingyang2,Zuo Houjuan3,Fei Yujie3,Peng Dan3,Huang Xiaolin1,Liu Zhengxiang3＊

(1Department of Rehabilitation Medicine,Tong ji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030;2Department of Cardiology of Zhejiang Provincial People’s Hospital,Hangzhou310014;3Department of cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical college,Huazhong University of Science and Technology,W uhan430030,China)

Objective To improve the delivery efficacy and target specificity of the pro-angiogenic gene CD151 to the ischemic heart Methods Taking pAAV-CD151 plasmid as the template and using clone technology,an AAV construct which includes hypoxia response element(HRE)and CD151 gene was generated to improve CD151 gene expression in the rat ischemic myocardiumResults Plasmid pAAV-HRECD151 was successfully constructed ,and the result was confirmed by sequencingConclusion Plasmid pAAV-HRE-CD151 was successfully constructed,which laid the foundation for the target study of the CD151 gene on ischemic heart

Cardiac ischemia; CD151; HRE; Gene therapy; pAAV-HRE-CD151

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.002

2010-12-10

2011-04-01

国家自然科学基金资助(30670856,81000047)

魏全,男(1979年),汉族,博士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)