β-葡萄糖苷酶的提取及转化大豆异黄酮的实验研究

河南质量工程职业学院 王振丽 王婷婷 马振兴 李书华

β-葡萄糖苷酶的提取及转化大豆异黄酮的实验研究

河南质量工程职业学院 王振丽 王婷婷 马振兴 李书华

大豆异黄酮（soybean insof avones，简称ISO）是一类存在于大豆中的具有重要生物活性的物质。它主要分为游离型苷元和结合型糖苷两大类，其生物活性主要表现为游离型苷元的生物活性。但是大豆异黄酮主要以结合型的糖苷（glucosides）形式存在，从大豆中提取的大豆异黄酮中游离型的苷元只占总量的2%～3%，结合型的糖苷占总量的97%～98%。研究发现，只有大豆异黄酮糖苷被水解脱去糖基转化成游离型的苷元才能被动物体吸收。目前，大都通过酸解法将结合型的糖苷降解成游离型的苷元，以提高大豆异黄酮中大豆苷元、染料木素的含量。这些方法工艺复杂、成本高、有机溶剂残留量高，未能得到大规模的应用。本文，笔者利用微生物法进行大豆异黄酮的转化实验，取得了良好效果。

一、实验准备

1.实验材料。经发酵培养后的固体培养基。

2.主要试剂及仪器。实验试剂主要有色谱甲醇、无水乙醇、冰乙酸、磷酸等；实验仪器主要有低温离心机、高效液相色谱仪等。

二、实验方法

1.β–葡萄糖苷酶酶液的浸提。采用固体发酵法将培养基培养72 h后，置于研钵中磨至小碎片，分别研究不同提取溶剂、浸提温度和浸提时间对β–葡萄糖苷酶活力的影响。

2.β–葡萄糖苷酶的转化。准确称取1.0 g 质量分数为10%的大豆异黄酮2份，分别置于1号和2号瓶中，1号瓶中加入适量蒸馏水作为对照，2号瓶中加入适量的发酵粗酶液，于55 ℃水浴锅中振荡水解7 h，然后将反应液置于4 ℃、5 000 r/min的离心机中离心15 min，沉淀干燥后用无水乙醇溶解，再用0.45μm滤膜过滤，取样品10μL。以甲醇∶水∶冰乙酸=42∶57∶1（体积比）为流动相进行样品分析。

三、实验结果分析

1. 提取溶剂对酶活力的影响。当以柠檬酸缓冲液及蒸馏水作为浸提剂时，酶活力较高；其值相差不大。考虑到成本及操作方便的问题，该实验以蒸馏水作为提取溶剂。不同提取溶剂对酶活力的影响结果见表1。

表1 不同提取溶剂对酶活力的影响

2. 不同提取温度对酶活力的影响。当温度为50℃时，酶活力最高，随后随着温度的升高，酶活力逐渐下降，确定最佳提取温度为50℃。实验结果如图1所示。

图1 不同提取温度对酶活力的影响

3.不同浸提时间对酶活力的影响。随着浸泡提取时间的延长，酶活力逐渐升高。当浸泡3 h时，β–葡萄糖苷酶活力达到最高。随后随着浸泡时间的延长，酶活力逐渐下降。因此确定其最佳浸提时间为3 h。实验结果如图2所示。

图2 不同浸提时间对酶活力的影响

4.酶解前后大豆异黄酮的色谱图。酶解前大豆异黄酮的色谱如图3所示，酶解后的色谱如图4所示。

图3 酶解前大豆异黄酮的色谱

图4 酶解后大豆异黄酮的色谱

由图3、图4可知，β–葡萄糖苷酶在最佳酶解条件下酶解10%大豆异黄酮，酶解后结合型的大豆异黄酮含量明显降低，游离型的大豆异黄酮含量明显升高。由此可知，酶解后游离型的苷元含量显著增加，提高了大豆异黄酮的利用率。

三、结论

1. 通过实验可知，β–葡萄糖苷酶酶液的最佳浸提条件为：以蒸馏水为浸提溶剂，浸提温度为50 ℃，时间为3 h。

2. 在一定条件下，大豆异黄酮在β–葡萄糖苷酶作用下，大豆异黄酮苷元的含量明显增加。由于大豆异黄酮苷元有利于动物体的吸收和利用，可提高其利用率。因此，用β–葡萄糖苷酶转化结合型大豆异黄酮有广阔的应用前景。