固相萃取-流动注射化学发光法测定奶粉中的三聚氰胺

高向阳，郝 梅，朱盈蕊

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

固相萃取-流动注射化学发光法测定奶粉中的三聚氰胺

高向阳，郝 梅，朱盈蕊

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

建立一种快速测定奶粉中三聚氰胺的新方法，利用鲁米诺-高锰酸钾化学发光体系，结合流动注射技术，对样品中的微量三聚氰胺进行测定。结果表明：三聚氰胺对鲁米诺-高锰酸钾化学发光体系具有显著的抑制作用，在最佳实验条件下，方法的线性范围为1×10-11～1×10-6mol/L，检出限(3RSN)为4.0×10-8mg/L，RSD为1.1%(n=11)，样品加标回收率为96.1%～102.2%，用于奶粉中三聚氰胺含量的测定，结果令人满意。

三聚氰胺；流动注射-化学发光；鲁米诺；高锰酸钾；奶粉

三聚氰胺，简称三胺，又称氰脲三酰胺、三聚氰酰胺、蜜胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，化学名称为2,4,6-三胺基-1,3,5-三嗪(2,4,6-triamino-1,3,5-triazine)或1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺(1,3,5-triazine-2,4,6-triamino)，分子式C3H6N8，相对分子质量126.12[1]。三聚氰胺是重要的氮杂环有机化工原料，主要用途是与醛缩合，生产塑料。三聚氰胺本身毒性较小，长期或反复摄入可能对肾和膀胱产生影响，导致结石产生[2]。但由于其含氮量高，又无气味和味道，常被不法商人用于冒充食品中的蛋白质。鉴于三聚氰胺的人为添加会对消费者造成危害，我国有关部门已发布了三聚氰胺限量值的公告[3-4]。

三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法[5-9]、液相-质谱法[10-12]、酶联免疫法[13-14]、毛细管电泳法[15-18]、气相色谱法[19]、荧光光度法[20]等，这些方法所用仪器昂贵、成本较高且操作繁杂，不利于普及应用。用流动注射化学发光法测定食品中三聚氰胺的研究尚未见报道。本实验利用三聚氰胺对鲁米诺-高锰酸钾体系发光强度的抑制作用，建立流动注射-化学发光快速测定三聚氰胺的新方法，旨在为奶粉中微量三聚氰胺的测定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

超市市售的5种不同品牌的奶粉。

三聚氰胺标准品(含量≥99%) 上海安谱公司；鲁米诺 苏州工业园区亚科化学试剂有限公司；高锰酸钾天津科密欧化学试剂开发中心；三氯乙酸 如皋市化学试剂厂；甲醇(色谱纯) 中国上海陆忠制剂厂；乙腈(色谱纯) 天津赛孚瑞科技有限公司；氨水 烟台市双双化工有限公司。其他试剂均为分析纯。

8×10-3mol/L三聚氰胺标准储备液：称取105℃烘干的三聚氰胺100mg，用重蒸水定容至100mL棕色容量瓶中，4℃冰箱保存，用时逐级稀释至所需质量浓度；1g/100mL三氯乙酸溶液；体积分数5%氨化甲醇溶液；0.1mol/L高锰酸钾溶液；5.0×10-2mol/L鲁米诺储备液：准确称取鲁米诺2.2140g，用0.1mol/L的氢氧化钠溶解并定容于250mL棕色容量瓶中，混匀避光保存两周后使用。

1.2 仪器与设备

IFFL-D流动注射化学发光分析仪 西安瑞迈电子科技有限公司；SYZ-B型石英亚沸高纯水蒸馏器 江苏宜兴市勤华石英玻璃仪器厂；PXSJ-216 型离子分析仪 上海精密科学仪器有限公司；TDL-5-A型低速台式离心机上海安亭科学仪器厂；固相萃取装置 上海西域有限公司；HY-5回旋式振荡器 金坛市杰瑞尔电器有限公司；氮吹仪 美国Organomation公司；所有玻璃器皿用5%的硝酸浸泡5h以上，用重蒸水洗净后投入使用。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

在设定工作条件下，不同浓度的三聚氰胺标准溶液用0.01～1mol/L的盐酸溶液调至pH2.50后，用pH2.50的盐酸溶液定容为50.00mL，混匀，与6×10-4mol/L鲁米诺溶液(pH12.50)及1×10-5mol/L高锰酸钾溶液依次进机测定其发光值，根据相对化学发光值与标准溶液浓度绘制的标准曲线，三聚氰胺浓度在1×10-11～1×10-6mol/L(1.26×10-6～0.126mg/L)范围内，浓度的负对数(－lgC)与相对化学发光强度呈良好的线性关系，y=538.5x＋56.259，r＝0.9991。

1.3.2 样品的处理、固相萃取和测定

称取2g(精确至0.0001g)乳粉试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL 1g/100mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min后，以4000r/min离心10min。上清液经1g/100mL三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用1g/100mL三氯乙酸溶液定容至25.00mL，移取5.00mL滤液，加入5.00mL水混匀后做待净化液。用3mL甲醇、3mL水活化阳离子交换固相萃取柱，移取3.00mL待净化液至固相萃取柱中，用3mL水和3mL甲醇淋洗，弃去淋洗液并将小柱抽至近干后，用6mL 体积分数5%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。固相萃取过程流速不超过1mL/min，洗脱液于50℃用氮气吹干，残留物用热重蒸水溶解，并调pH2.50，冷至室温后定容于50mL容量瓶，此为样品待测液。在与绘制标准曲线的相同条件下测定，由标准曲线求出待测液的浓度CRE/(mol/L)，按下式计算样品中三聚氰胺的含量ω/(mg/kg)。

式中：m为样品称取量/g；126.12为三聚氰胺的基本计算单元/(g/mol)。

2 结果与分析

2.1 测定条件的选择

2.1.1 化学发光仪工作参数的设定

在光电倍增管负高压400V、增益1的条件下，对仪器工作参数进行优化，实验表明：仪器在表1参数下运行，发光信号稳定，且具有最大的信噪比。

表1 化学发光仪工作参数的设定Table 1 Working parameters of chemiluminescence instrument

2.1.2 鲁米诺分析液的pH值和浓度的选择

实验选用NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Na2CO3-NaHCO3等调节鲁米诺溶液的碱性，发现在NaOH溶液中化学发光信号较强，故选用NaOH调节鲁米诺的pH值。实验在试液pH2.50、高锰酸钾2×10-5mol/L，鲁米诺6×10-4mol/L条件下进行。鲁米诺的pH值对相对化学发光强度的影响如图1所示，当鲁米诺pH值为12.50时，发光信号最强。因此，调节鲁米诺的pH值为12.50。

图1 鲁米诺的pH值对相对化学发光强度的影响Fig.1 Effect of pH on relative chemiluminescence intensity

在鲁米诺pH12.50，试液pH2.50，高锰酸钾浓度2×10-5mol/L的条件下，鲁米诺浓度对相对化学发光强度的影响见图2。

图2 鲁米诺浓度对相对化学发光强度的影响Fig.2 Effect of luminol concentration on relative chemiluminescence intensity

由图2可知，鲁米诺浓度6×10-4mol/L 时测定的灵敏度较高，相对化学发光强度较为理想，选择此浓度进行测定。

2.1.3 高锰酸钾浓度的选择

图3 高锰酸钾浓度对相对化学发光强度的影响Fig.3 Effect of potassium permanganate concentration on relative chemiluminescence intensity

按表1工作参数，在试液pH2.50、6×10-4mol/L鲁米诺pH12.50条件下，高锰酸钾浓度对相对发光强度的影响见图3。由于体系的相对发光强度随高锰酸钾溶液浓度的增大而线性增强，综合考虑，实验选择高锰酸钾溶液的浓度为1×10-5mol/L。

2.1.4 三聚氰胺溶液最佳pH值的确定

三聚氰胺分析液的pH值是影响化学发光强度的重要因素。固定鲁米诺溶液的pH12.50、浓度6×10-4mol/L，高锰酸钾浓度1×10-5mol/L，三聚氰胺试液浓度1×10-6mol/L时，用0.01～1mol/L盐酸调节三聚氰胺试液的pH值。结果表明，三聚氰胺溶液对体系的抑制作用随pH值的减小而增大，但当溶液pH值小于2时，发光信号不稳定，故选择三聚氰胺分析液的最佳pH值为2.50。

2.2 检出限、精密度和定量限

对1×10-6mol/L三聚氰胺标准溶液平行测定11次，相对标准偏差(RSD)为1.1%；以3倍空白标准偏差计算的检出限为4.0×10-8mg/L(n=11)，工作曲线测定的定量限为1.05×10-4mg/kg，优于已有文献[5,21]的报道。

2.3 干扰实验

在最佳实验条件下，研究了样品中可能的共存物对三聚氰胺测定的影响。实验结果表明，对1×10-6mol/L的三聚氰胺，允许误差为±5%时，100倍的K+、Na+、Zn2+、NH4+、Cl-、SO42-；20倍的淀粉、葡萄糖、乳糖；10倍的Cu2+、Mg2+；5倍的Ca2+不干扰测定。

2.4 样品测定

由表2可知，所选奶粉样品中，两个样品未检出，其余3个样品中三聚氰胺的含量在1.5×10-2～3.9×10-2mg/kg，均未超过规定限量值[3]，测定的相对标准偏差RSD均不大于4.6%。

表2 不同乳粉样品中三聚氰胺含量Table 2 Contents of melamine in different milk powder samplesmg/kg

2.5 回收率实验

以市售奶粉品牌一为样品，进行加标回收率实验，结果如表3所示。由此可知，样品测得的回收率在96.1%～102.2%之间。

2.6 提取及净化条件的选择

样品预处理参照GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》进行[21]，三聚氰胺能够溶于1g/100mL三氯乙酸和乙腈，二者能够使乳粉样品中的蛋白质沉淀析出，更有利于后续净化和检测，结果表明：选用二者为沉淀剂和提取剂效果良好。三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型阳离子交换小柱(PCX柱)通过将磺酸基团键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，能够有效去除干扰杂质，得到满意的净化效果，回收率令人满意。

表3 回收率测定结果Table 3 Recovery rates for melamine in a certain brand of milk powder

表4 不同方法的参数比较Table 4 Comparison of different methods to determine melamine

2.7 分析方法比较

将本实验所得的分析参数进行换算并与文献中的其他方法进行比较，结果如表4所示。

从表4可以看出，流动注射化学发光法的线性范围宽，精密度好，灵敏度比其他方法高2～4个数量级。

3 结 论

基于三聚氰胺对鲁米诺与高锰酸钾之间的化学发光反应具有显著的抑制作用，建立了测定三聚氰胺的流动注射化学发光新的分析方法。方法简单、快速、准确，分析成本低廉，灵敏度明显高于现行标准[21]，用于奶粉样品中三聚氰胺含量的测定，结果令人满意。

[1] 杨盛林, 黄思玲. 三聚氰胺的性质检测、方法及毒理学[J]. 食品与药品, 2008, 10(11): 66-69.

[2] 孙贵朋, 谢云飞, 许学书, 等. 三聚氰胺的危害及检测[J]. 上海食品药品监管情报研究, 2008(5): 42-47.

[3] 卫生部等五部门联合公告2008第25号. 关于乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值规定的公告[S]. 2008-10-07.

[4] 农业部公告第1218号. 关于饲料原料和饲料产品中三聚氰胺限量值定的公告[S]. 2009-06-08.

[5] 中国计量科学研究所. GB/T 22400—2008 原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[6] 李燕, 柴勇, 龚久平, 等. 液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺的方法优化[J]. 食品科学, 2009, 30(14): 227-229.

[7] 王登飞, 黄智辉, 郑俊超, 等. 固相萃取-高效液相色谱法测定食用菌中三聚氰胺残留量[J]. 食品科学, 2010, 31(6): 235-238

[8] KIM B, PERKINS L B, BUSHAW R J. Determination of melamine in pet food by enzyme immunoassay high-performance liquid chromatography with diode array detection, and ultra-performance liquid chromatography with tandem mass apectrometry [J]. JAOAC Int, 2008, 91(2):408-413.

[9] MUNIZ-VALENCAI R, CEBALLOS-MAGANA S G, ROSALESMARTINEZD, et al. Method development and validation for melamine and its derivatives in rice concentrates by liquid chromatography application to animal feed samples[J]. Anal Bioanal Chem, 2008, 392(3):523-531.

[10] 赵慧芬, 水明, 张雪林, 等. 液相色谱-质谱/质谱法测定乳品中三聚氰胺含量的简便方法[J]. 中国奶牛, 2009(1): 43-45.

[11] 李秀琴, 张庆和, 全灿, 等. 液相色谱-质谱/质谱法对多种食品基体中三聚氰胺的检测[J]. 分析测试学报, 2009, 28(11): 1260-1265.

[12] ANDERSEN W C, TUPNIPSEED S B, KARBIWNYK C M, et al.Determination and confirmation of melamine residues in catfish, trout,tilapia, salmon, and shrimp by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(12): 4340-4347.

[13] 李宏, 贾青, 杨汉卿, 等. 饲料中三聚氰胺ELISA检测方法的优化初探[J]. 饲料广角, 2009(20): 40-41.

[14] 李峰, 王莉, 柴春彦, 等. 检测牛乳中三聚氰胺的间接竞争ELISA方法的建立[J]. 中国动物检疫, 2009, 26(9): 47-49.

[15] 饶钦雄, 童敬, 郭平, 等. 高效毛细管电泳测定鸡蛋中三聚氰胺[J].分析化学, 2009, 37(9): 1341-1344.

[16] 饶钦雄, 童敬, 郭平, 等. 高效毛细管电泳测定牛奶和奶粉中残留的三聚氰胺[J]. 色谱, 2008, 26(6): 755-758.

[17] 丁晓静, 杨媛媛, 赵珊, 等. 高效毛细管电泳法快速测定乳制品中三聚氰胺[J]. 食品科学, 2009, 30(18): 245-248.

[18] 王松, 陈锦, 姜欣, 等. 毛细管电泳-化学发光法快速检测三聚氰胺[J]. 湖北师范学院学报, 2010, 30(1): 67-71.

[19] 周德刚, 贾涛. 气相色谱质谱联用法检测牛奶中三聚氰胺的探讨[J].饲料检测, 2009(9): 41-48.

[20] 黄晖, 李丽, 马乔, 等. 表面活性剂增敏荧光光度法测定牛奶中的三聚氰胺[J]. 分析化学, 2010, 38(2): 249-252.

[21] 中国计量科学研究所. GB/T 22388—2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

Determination of Melamine in Milk Powder by Flow Injection-Chemiluminescence Combined with Solid Phase Extraction

GAO Xiang-yang，HAO Mei，ZHU Ying-rui
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to establish a new method to quickly determine melamine in milk powder, a chemiluminescence (FI-CL)system of luminol and potassium permanganate was coupled with flow injection technology. In the method, the chemiluminescence (CL) reaction between luminol and potassium permanganate was significantly reduced by melamine. Under the optimal experimental conditions, melamine concentration in the range of 1 × 10-11to 1 × 10-6mol/L was linearly proportional to the depression of CL signals. The detection limit was 4.0 × 10-8mg/L, with a RSD of 1.1% for 11 replicate determinations. The recovery rates for melamine in a certain brand of milk powder were in the range of 96.1% to 102.2%. This method has been successfully applied to the determination of melamine in real milk powder samples.

melamine；flow injection-chemiluminescence；luminol；potassium permanganate；milk powder

O657.39

A

1002-6630(2011)10-0199-04

2010-08-19

河南省重点学科建设基金项目(10466-X-082301)

高向阳(1949—)，男，教授，本科，主要从事食品安全分析研究。E-mail：ndgaoxy@163.com