黄山贡菊高效液相色谱指纹图谱的建立

査芳芳，高学玲,*，邹敏亮，何常明，贺曼曼

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.健士星生物技术研发(上海)有限公司，上海 200335)

黄山贡菊高效液相色谱指纹图谱的建立

査芳芳1，高学玲1,*，邹敏亮2，何常明2，贺曼曼1

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.健士星生物技术研发(上海)有限公司，上海 200335)

目的：研究黄山贡菊高效液相色谱指纹图谱的建立方法，为其质量控制和科学评价提供依据。方法：采用高效液相色谱法测定28种不同来源的菊花样品，用药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A进行评价，建立共有模式。结果：建立了黄山贡菊的指纹图谱，确定了12个共有峰，各贡菊样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均在0.96以上，与其他菊花品种的相似度均小于0.86。结论：此方法简便、准确、重复性好，可用于黄山贡菊药材质量控制与评价。

黄山贡菊；高效液相色谱法(HPLC)；指纹图谱；相似度

黄山贡菊亦称“徽州贡菊”，产自著名的旅游胜地黄山地区，与杭菊、亳菊、滁菊共同收载于2010年版《中国药典》[1]。贡菊为多年生草本菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat.)的头状花序，具有疏风清热、平肝明目、清热解毒之功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等症[1]。现代研究表明，黄山贡菊主要活性成分包括酚酸、黄酮及其苷类、挥发油等[2-4]，具有抗菌、抗氧化、降低血压和调节血脂含量等多方面药理作用[5-7]。黄山贡菊既有观赏价值，又有饮用和药用功能，是药食兼用之佳品。

目前，关于黄山贡菊药材的质量控制大部分还停留在药材性状鉴别和冲泡时风味口感等感官鉴别上，仅有部分文献对菊花其他品种高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)指纹图谱进行研究[8-10]，尚未见关于黄山贡菊中主要成分酚酸及黄酮类化合物的鉴别及指纹图谱研究的报道。本研究应用高效液相色谱法对不同种植地、采摘批次的黄山贡菊及其他品种菊花的主要功效成分酚酸及黄酮类化合物进行指纹图谱研究，以期为贡菊的质量控制建立有效方法，并为药材鉴别和规范种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用黄山贡菊(GJ-4)均采自黄山贡菊各种植地，其他菊花购于各主产地药材公司，所有菊花样品均由复旦大学药学院何常明博士鉴定。

木犀草苷、绿原酸、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品(纯度≥98%) 成都曼思特生物科技有限公司；甲酸(色谱纯) 美国Tedia公司；乙腈(色谱纯) 德国Merck公司；超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱系统(配有四元泵、在线真空脱气系统、自动进样器、柱温箱、VWD检测器、Chem Station工作站) 美国Agilent公司；RUC-5200型超声波清洗机 上海睿祺公司；TL-5.0W台式离心机 上海市离心机械研究所有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus Phenyl- Hexyl(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1；流速1.0mL/min，检测波长327nm，柱温30℃，进样量5μL。以木犀草苷的色谱峰计算理论塔板数不低于7万。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution program for HPLC fringerprinting of Huangshan Gongju chrysanthemum

1.3.2 对照品溶液制备

精确称取木犀草苷对照品适量，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得含0.04g/L木犀草苷溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3.3 供试品溶液的制备

精密称取菊花粉碎样1g(过24目筛)，先用20mL 75%乙醇浸泡30min，再放入50℃超声提取器超声提取30min，用滤纸进行抽滤，滤液用75%乙醇定容至100mL容量瓶中，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，滤液贮存备用。

1.3.4 样品测定

按1.3.3节条件制备28种不同来源菊花供试品溶液，按1.3.1节色谱条件进行测定，记录色谱图。

2 结果与分析

2.1 精密度实验

取黄山贡菊样品(GJ-4)供试液，按1.3.1节色谱条件连续进样6次，相似度结果均在0.99以上，各色谱峰峰面积的 RSD值小于1.2%。

2.2 稳定性实验

取黄山贡菊样品(GJ-4)供试液，分别在0、2、4、8、12、24h按1.3.1节色谱条件进样检测，各主要色谱峰保留时间的相对标准偏差为0.014%～0.140%，峰面积的相对标准偏差为0.205%～3.543%。结果表明，黄山贡菊供试液在室温条件24h内稳定。

2.3 重复性实验

精密称取同一贡菊样品(GJ-4)6份，按1.3.3节方法制备供试液，按1.3.1节色谱条件进样分析，记录色谱图，计算出相似度在均在0.99以上，各主要色谱峰保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于2.0%，表明重复性良好，符合指纹图谱要求。

表2 黄山贡菊HPLC指纹图谱相对保留时间Table 2 Relative retention time of main peaks in the HPLC fingerprint of Huangshan Gongju chrysanthemum

表3 黄山贡菊HPLC指纹图谱峰面积Table 3 Relative areas of main peaks in the HPLC fingerprint of C. morifolium Ramat.

2.4 黄山贡菊 HPLC指纹图谱中的特征峰

根据13个不同来源贡菊的 HPLC指纹图谱的检测结果，确定12个共有色谱峰，共有峰面积占总峰面积比例的90%以上；除对照峰3为木犀草苷外，峰1、6、7经与对照品比较，分别鉴定为绿原酸、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸。以峰3(木犀草苷)为内参比峰，结果显示黄山贡菊样品指纹图谱中共有峰相对保留时间为0.446～2.214min，相对保留时间的相对标准偏差为0.001%～0.130%(表2)，表明所有贡菊花样品出峰时间一致，色谱条件稳定、可靠；峰面积的RSD值为17.1%～41.2%(表3)。通过对照品比较及紫外吸收特征，将12个共有峰分为2类，Ⅰ为酚酸类(包括峰1、2、5、6、7、10、12)；Ⅱ为黄酮类(包括峰3、4、8、9、1 1)。

2.5 各菊花样品的指纹图谱相似度评价

从各产地采集的菊花样品，采用药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度系统2004A”软件，生成贡菊药材共有模式的对照指纹图谱(图1)，相似度评价结果见表4，各菊花样品叠加指纹图谱见图2，菊花及金银花样品指纹图谱见图3。根据相似度结果，不同种植地、不同采收时间的黄山贡菊被正确区分出来，相似度在0.96～1.00之间，而与其他品种菊花样品的相似度均小于0.86。

图1 黄山贡菊HPLC对照指纹图谱Fig.1 Control HPLC chromatogram of 13 Huangshan Gongju chrysanthemum

表4 与共有模式比较的各样品相似度评价Table 4 Similarity evaluation of 28 Huangshan Gongju chrysanthemum samples with the common pattern

图2 菊花样品指纹图谱Fig.2 Overlapped HPLC fingerprint chromatograms of 28 Huangshan Gongiu chrysanthemum samples

图3 菊花及金银花样品指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprint chromatograms of Huangshan Gongju chrysanthemum and Lonicera japonica flower

3 讨 论

本实验对黄山贡菊进行了HPLC指纹图谱研究，结果表明，不同来源的贡菊化学成分既有相关性，又有所区别。所有贡菊样品共有峰一致，表明所含化学成分相近，主要为酚酸和黄酮类成分；但受种植地、采摘时间等因素的影响，各色谱峰的峰面积相差很大(相对标准偏差为17.1%～41.2%)，即表明不同成分相对含量有明显差异。GJ-6、GJ-7、GJ-8是为同一种植地不同时间采集的3批贡菊样品，其中11月中旬和12月上旬采收的贡菊内成分含量远低于11月下旬的含量，表明11月下旬采收的贡菊质量最佳。JH-14～JH-17为七月菊，又称早贡菊，可以看到七月菊与贡菊在内成分含量上有很大区别，七月菊木犀草苷(峰3)的含量很低，但是峰11的含量却是贡菊中峰11含量的6～8倍，且七月菊中不含有峰12。在表3中金香菊、黄菊、万寿菊、野菊花与贡菊在内成分含量和数量上区别也有很大的，尤其是野菊花，检测发现其内成分数量比贡菊的减少了一半，而杭白菊的内成分却比贡菊丰富得多(图2、3)。表4相似度结果进一步证明：黄山贡菊质量较为稳定、均一，相似度大于0.96，与其他品种的菊花差异显著，相似度均小于0.86。因此，可通过 HPLC指纹图谱的方法有效保证黄山贡菊药材的质量稳定。

本实验研究发现，峰9在贡菊和杭白菊色谱图中出峰清晰，峰面积可观，但在亳菊、滁菊，祁菊、怀菊和野菊花中均未检测到，是贡菊和杭白菊的特有成分；峰10在贡菊、杭白菊、滁菊及野菊花色谱图中出峰明显，但在亳菊、祁菊、怀菊中含量很低或不含，是贡菊、杭白菊及滁菊的特有成分；1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(峰6)在所有样品中出峰稳定、峰面积显著，是菊花的特征性成分。

2010年版《中国药典》中菊花以绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为主要指标成分，其中规定木犀草苷(峰3)的含量不得少于0.080%。从表3可知，亳菊、滁菊、怀菊和祁菊中木犀草苷峰面积非常低，有的甚至不含有。因此，以木犀草苷作为菊花的指标性成分进行质量控制是否合适还值得商榷。

2010版《中国药典》中金银花以绿原酸和木犀草苷作为指标成分，但金银花中3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量非常高[11-12]。从图3可知，如果把3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸作为菊花的指标成分，可能会导致菊花和金银花药材的滥用、混用；而1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸在所有菊花样品中均含有，是菊花的特有成分，因此，可考虑将1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(峰6)增加作为菊花品种的指标性成分进行质量控制。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 192.

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HPLC Fingerprinting of Huangshan Gongju Chrysanthemum (Chrysanthemum morifoliumRamat.)

ZHA Fang-fang1，GAO Xue-ling1,*，ZOU Min-liang2，HE Chang-ming2，HE Man-man1
(1. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. Healthy-Star Biotech R&D Co. Ltd., Shanghai 200335, China)

Objective: To establish the HPLC fingerprint of Huangshan Gongju chrysanthemum (Chrysanthemum morifoliumRamat.) for its quality control and evaluation. Method: A total of 28 chrysanthemum samples of different geographical origins were determined by HPLC and evaluated using the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine to construct a common pattern. Results:Twelve common peaks were identified in the established fingerprints, each of which shared a similarity exceeding 0.96 with the control fingerprint and a similarity below 0.86 with other chrysanthemum varieties. Conclusion:The proposed method is simple, accurate, repeatable and suitable for quality control and evaluation of Huangshan Gongju chrysanthemum.

Huangshan Gongju chrysanthemum；high performance liquid chromatography (HPLC)； chromatographic fingerprint；similarity

TS207.3

A

1002-6630(2011)20-0146-05

2011-01-18

国家星火计划项目(2010GA710027)

査芳芳(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为植物源食品质量与安全。E-mail：zhafangfang0921@hotmail.com

*通信作者：高学玲(1967—)，女，副教授，硕士，研究方向为食品饮料加工。E-mail：shling@ahau.edu.cn