菊苣中菊苣酸提取工艺优化

华 春，李建玲，周 峰，周泉澄，张边江，王仁雷*，赵梦丹(.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 7；.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 0046；3.江苏教育学院，江苏 南京 003)

菊苣中菊苣酸提取工艺优化

华 春1，李建玲2，周 峰1，周泉澄1，张边江1，王仁雷3,*，赵梦丹2
(1.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 211171；2.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046；3.江苏教育学院，江苏 南京 210013)

以荷兰菊苣为材料，采用高效液相色谱法测定菊苣酸的含量，建立菊苣酸提取工艺优化方法。通过单因素试验分析回流温度、甲醇体积分数、回流时间及料液比4个主要因素对菊苣酸提取量的影响，在单因素试验基础上采用L9(34)正交试验进一步优化菊苣中菊苣酸提取工艺条件。结果表明：菊苣中菊苣酸的最佳提取工艺为回流温度60℃、70%甲醇、料液比1:60(g/mL)、回流1h。在此条件下菊苣中菊苣酸提取量为8.808mg/g(干质量)。关键词：菊苣；菊苣酸；提取工艺；高效液相色谱法

菊苣(Cichorium lntybusL.)为菊科(Asteraceae Compositae)菊苣属(CichoriumL.)一年生或多年生草本植物。菊苣耐盐碱，在土壤含盐量0.168%时生长良好[1]，在江苏的沿海滩涂广泛分布。菊苣地上部分的叶片含有蛋白质、脂肪酸、糖类、黄酮、菊苣酸、多种维生素等生物活性成分，是一种新型的保健海水蔬菜。肉质根含有菊粉(Inulin)、绿原酸和苦味酸等，是工业和药品的生产原料[2-3]。菊粉是一种功能性低聚果糖，也是一种可溶性膳食纤维，对控制人的体质量、改善肠道功能、防止机体失调以及老年性疾病很有帮助[4]。绿原酸和苦味酸能增加咖啡的溶解质量，缓和咖啡的刺激作用[5]，因而成为咖啡的添加物和替代品。菊苣的地上部分和地下块根加工后的残渣均是很好的饲料，其无氮浸出物、粗蛋白、粗灰分、粗纤维和脂肪5项营养成分指标的含量均高于玉米[6-7]。菊苣酸是菊苣茎叶中一种重要的免疫活性成分之一，近年来药理研究表明，菊苣酸具有增强免疫功能和抗炎作用[8]，并能抑制透明质酸酶，保护胶原蛋白免受可致降解的自由基的影响[9]，还具有抑制HIV1和HIV2整合酶[10]，促进胰岛素释放[11]的作用。作为一种宝贵的植物资源，菊苣的开发利用具有广阔前景。

目前，国内外对菊科其他植物中菊苣酸的研究有一定进展，对其提取工艺的优化研究已有报道[12]，而对菊苣中菊苣酸提取工艺及测定研究未见报道。本实验通过对菊苣地上部分菊苣酸提取的研究，探讨最佳提取工艺，为开发利用新型保健海水蔬菜菊苣提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

菊苣(Cichorium lntybusL.)种子由南京农业大学资源与环境学院提供提供。在温度23℃，湿度88%的人工气候室中用Hoagland营养液沙培生长30d。取其地上部分，37℃恒温干燥箱24h烘干，粉碎过40目筛备用。

菊苣酸标准品(≥98%) 中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)。

LC-20AT型高效液相色谱仪 日本岛津公司；LAC164型电子分析天平 上海精科公司；DHG-9141A型电热恒温干燥箱 上海博讯公司；Milli-Q超纯水仪南京易普易达公司。

1.2 方法

1.2.1 菊苣酸提取工艺

精密称取0.2g菊苣地上部分干粉，置于圆底烧瓶中，按照设定的料液比加入甲醇溶液，水浴回流，提取液滤纸过滤，再过0.25μm的微孔滤膜，滤液待用。

通过单因素试验分析回流温度、甲醇体积分数、回流时间及料液比4个因素对菊苣酸提取量的影响，并在单因素试验基础上采用L9(34)正交试验进一步优化菊苣中菊苣酸提取工艺条件。

1.2.2 色谱条件

色谱柱Zorbax SB C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(25:75)，流速0.7mL/min；柱温40℃；检测波长335nm，进样量20μL[13]。

1.2.3 标准品溶液的制备

精密称取菊苣酸标准品5mg，置50mL容量瓶中，精密加入70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜待用，即得质量浓度0.1mg/mL标准品溶液。

1.2.4 标准曲线绘制

精密量取质量浓度0.1mg/mL的菊苣酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于5mL容量瓶中，精密加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的标准溶液。分别吸收20μL注入HPLC仪中，按照1.2.2节色谱条件测定，记录色谱图及其峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，菊苣酸质量浓度(X)/(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线[14]。得到标准曲线方程为：Y＝5.1×107X－13353，r＝0.9995，线性范围0.02～0.1mg/mL。

1.2.5 菊苣酸含量测定

图1 菊苣酸标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of standard cichoric acide

精密称取菊苣地上部分干粉0.2g，按照1:70料液比加入70%甲醇，50℃回流提取1.5h，提取液过滤，过滤后的提取液以0.25μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。按照1.2.2节色谱条件测定峰面积，再根据标准曲线计算得样品菊苣酸的质量浓度。做3次平行实验，取平均值。样品色谱图见图2。

样品菊苣酸含量/mg＝样品中菊苣酸质量浓度×提取液体积

图2 样品中菊苣酸色谱图Fig.2 Chromatograph of cichoric acid in extract samples

1.2.6 精密度实验

精密吸取质量浓度0.1 mg/mL的标准品溶液20μL，测得菊苣酸的峰面积，重复5次，计算得RSD＝1.01%，n＝5。

1.2.7 稳定性实验

精密吸取质量浓度0.087mg/mL样品溶液，每隔1h进样20μL，测得峰面积，重复5次，计算得RSD＝1.33%，n＝5。

1.2.8 回收率实验

采用加样回收法[15]，取已知含量的样品5份，分别添加菊苣酸对照品，按样品制备法制备供试液，按照上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果平均回收率为1.061，RSD＝1.33%，n＝5。

1.2.9 数据处理

所有数据均为3次平行实验的平均值，运用SPSS统计软件和Excel软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 回流温度对提取效果的影响

精密称取菊苣地上部分干粉0.2g，放入150mL圆底烧瓶中，按照1:50的料液比加入70%甲醇10mL，然后分别在40、50、60、70、80、90℃水浴条件下回流1.5h。回流提取液，滤纸过滤，再过0.25μm微孔滤膜，计算滤液中菊苣酸提取量。

图3 回流温度对菊苣酸提取量的影响Fig.3 Effects of reflux temperature on cichoric acid yield

由图3可见，随着回流温度的增高呈先增加后下降的变化规律。回流温度40、50、60℃对菊苣酸提取量的影响不显著(P＞0.05)，60、70、80、90℃对菊苣酸提取量影响极显著(P＜0.01)，回流温度50℃时提取效果最好，菊苣酸提取量为7.485mg/g。因此，确定最佳回流温度为50℃。

2.2 甲醇体积分数对提取效果的影响

在其他条件不变的情况下，考察甲醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%对提取效果的影响。

图4 甲醇体积分数对菊苣酸提取量的影响Fig.4 Effects of methanol concentration on cichoric acid yield

由图4可见，随着甲醇体积分数的提高而呈先增加后下降的变化规律。甲醇体积分数50%和60%对菊苣酸提取量的影响不显著(P＞0.05)，70%、80%、90%甲醇体积分数对菊苣酸提取量影响极显著(P＜0.01)，其中甲醇体积分数为70%时，提取效果最好，菊苣酸提取量为7.485mg/g。因此，甲醇体积分数70%最好。

2.3 回流时间对提取效果的影响

在其他条件不变的情况下，考察回流时间分别1.0、1.5、2.0、2.5h对提取效果的影响。

图5 回流时间对菊苣酸提取量的影响Fig.5 Effects of reflux duration on cichoric acid yield

由图5可见，回流时间对菊苣酸提取量的影响明显，随着回流时间的延长，呈现先上升后下降的变化规律。回流时间与菊苣酸提取量的关系显著(P＜0.05)，其中回流时间为1.5h时，提取效果最好，菊苣酸提取量为7.485mg/g。与其他因素水平差异显著(P＜0.05)。因此，选定回流时间为1.5h。

2.4 料液比对提取效果的影响

在其他条件不变的情况下，考察料液比分别为1:40、1:50、1:60、1:70、1:80(g/mL)对提取效果的影响。

图6 料液比对菊苣酸提取量的影响Fig.6 Effects of solid-to-liquid ratio on cichoric acid yield

由图6可见，溶剂用量对菊苣酸提取量的影响明显，随着提取溶剂用量增大而先上升后下降。1:40、1:50、1:60(或1:70)、1:80料液比与菊苣酸提取量的关系极显著(P＜0.01)，1:60和1:70的料液比对菊苣酸提取量的影响不显著(P＞0.05)。料液比为1:70时，提取效果最好为8.732mg/g。由于随着提取溶剂用量的增大试验误差增大，且从节约资源的角度考虑，选择1:60为最佳料液比。

2.5 菊苣酸提取工艺正交试验

对影响菊苣酸提取量的4个因素：回流温度、甲醇体积分数、回流时间及料液比进行三水平四因素正交试验。因素水平安排表1，结果见2。

表1 菊苣酸提取工艺正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test design

表2 菊苣酸提取工艺L9(34)正交试验设计及结果Table 2 Results of L9(34) orthogonal test

从表2极值可知，4个因素对菊苣中菊苣酸的提取量均有影响，各因素影响的主次顺序是：回流温度＞甲醇体积分数＞料液比＞回流时间。提取菊苣中菊苣酸的最佳工艺为：回流温度60℃、70%甲醇、回流时间1h，料液比1:70，菊苣酸提取量为8.537mg/g。从节约能源和减少误差的角度考虑，料液比宜采用1:60。按照最佳工艺条件进行验证实验，菊苣酸提取量为8.808mg/g，说明所选取的工艺确实为最佳工艺。

3 讨 论

3.1 通过单因素和L9(34)正交试验确定了提取菊苣酸的的最佳工艺条件：回流温度60℃、70%甲醇、回流时间1h、料液比1:60，菊苣酸提取量为8.808mg/g。菊苣酸提取量为稳定性实验(RSD＝1.33%)表明该提取工艺稳定性好。另外，操作简便，生产成本较低的优点，为菊苣的研究与开发打下必要的基础。

3.2 菊苣中菊苣酸的提取一般采用水、甲醇、乙醇、色谱级甲醇或超临界萃取，由于水提取温度较高，容易造成菊苣酸的氧化[16]且效率低；乙醇易挥发易燃烧，浓度高时组织内的菊苣酸溶解度降低导致菊苣酸不能提取出来[16]；普通分析甲醇提取容易造成有机溶剂残留，降低产品的质量[12]；超临界萃取成本较高，收率低，尚未完成工业化研究[12]。本实验采用色谱级甲醇为提取溶剂，不含杂质，提取效果好，成本较低。

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Process Optimization for Cichoric Acid Extraction fromCichorium lntybusL. Shoots

HUA Chun1，LI Jian-ling2，ZHOU Feng1，ZHOU Quan-cheng1，ZHANG Bian-jiang1，WANG Ren-lei3,*，ZHAO Meng-dan2

(1. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 211171, China；2. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；3. Jiangsu Institute of Education, Nanjing 210013, China)

The purpose of this study was to optimize the extraction of cichoric acid fromCichorium lntybusL. by methanol reflux extraction and then establish an HPLC method for determining cichoric acid content inCichorium lntybusL. One-factorat-a-time experiments were conducted to understand the effects of reflux temperature, methanol concentration, extraction time and solid-to-liquid ratio on extraction efficiency of cichoric acid. Based on this, an L9 (34) orthogonal array design was employed to optimize extraction efficiency of cichoric acid. The results demonstrated that the optimal conditions for cichoric acid extraction were reflux temperature of 60 ℃, solid-to-liquid ratio of 1:60 (g/mL), methanol concentration of 70%, and reflux duration of 1 h. Under the optimal conditions, the extraction efficiency of cichoric acid was 8.808 mg/g dry basis.

Cichorium lntybusL.；cichoric acid；process optimization；HPLC

R284.2

A

1002-6630(2011)20-0126-04

2011-06-29

江苏省高校自然科学基础研究面上项目(KJD180118)；江苏省植物生理学精品课程建设项目(2010)；江苏省现代教育技术研究重点课题(2010)；南京市环境科学重点学科建设项目(2011)

华春(1963—)，女，教授，本科，研究方向为植物逆境生理。E-mail：hc3501988@163.com

*通信作者：王仁雷(1963—)，男，教授，博士，研究方向为植物逆境生理。E-mail：wrl3501988@163.com