四角蛤蜊天然提取物制备工艺参数优化

舒留泉，易小兰，徐文渊，姚兴存

(淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005)

四角蛤蜊天然提取物制备工艺参数优化

舒留泉，易小兰，徐文渊，姚兴存

(淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005)

对四角蛤蜊软体部一般成分和氨基酸组成进行分析，结果(以干基计)粗蛋白和粗脂肪质量分数分别为60.14%和6.08%，17种氨基酸总量为48.09%，其中必需氨基酸质量分数为18.94%，占氨基酸总量的 39.38%，呈味氨基酸质量分数为22.73%，占氨基酸总量的47.27%。在单因素试验的基础上，以温度、加盐量、pH值为影响因素，利用响应面方法对四角蛤蜊天然提取物制备工艺进行优化，得到的最佳工艺参数为温度82.07℃、pH7.87、加盐量1.75%，提取率为54.78%。

四角蛤蜊；成分；天然提取物；响应面法

四角蛤蜊(Mactra veneriformis)，俗名白蛤、白蚬子，属瓣鳃纲真瓣鳃目蛤蜊科，是我国近海滩涂重要经济贝类之一，它含有丰富的蛋白质和多糖等营养成分，且具有肉味咸寒，有滋阴、利水、化痰的功效[1]，但由于其胃中含有大量的泥沙且不易清除，因而得不到充分开发利用[2]，对其深加工报道较少。

响应面法是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面[3-5]。其设计方案中的中心组合设计对因素和水平组合具有广泛的适用性，是研究多因素问题强有力的工具，在食品工业中应用最为广泛[6]。本研究首先对地产四角蛤蜊原料的一般化学成分和氨基酸组成进行分析，然后在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对四角蛤蜊软体部位天然提取物制备工艺进行优化，旨在为四角蛤蜊的加工利用，特别是天然海鲜调味料的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四角蛤蜊购于连云港。

乙腈(色谱纯) 山东禹王实业有限公司；GBW(E)100062十七种氨基酸混合溶液标准物质(BW3490) 国家标准物质网产品中心；正己烷、醋酸钠、醋酸、硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、石油醚、硼酸、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；LC98-1AAA氨基酸分析系统 北京温分公司；TGL-16M型台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机 江苏省金坛市荣光仪器制造公司；HW·YS型电子恒温水浴锅浙江舟山市定海区海源仪器厂；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；氨基酸专用色谱柱 美国迪马公司。

1.3 方法

1.3.1 一般成分测定[7]

水分：直接干燥法；蛋白质：微量凯氏定氮法；脂肪：索氏抽提法；灰分：灼烧称量法；总糖：蒽酮比色法。

1.3.2 四角蛤蜊蛋白质氨基酸组成分析[8-10]

准确称取100mg左右干燥后的样品放入水解罐中，加入6mol/L HCl 4mL，于110℃水解24h，冷却后用去离子水全部转移到50mL容量瓶中并定容，双层滤纸过滤，取滤液lmL置于25mL小烧杯中，在加NaOH的真空干燥器中蒸干，加入1mL pH2.2盐酸溶解后备用。

取200μL标样或样品于离心管中分别加入衍生试剂S、Y各100μL，室温静置1h，加入正已烷400μL，振荡后静置10min，取下层清液2μL注入色谱仪。

色谱条件：氨基酸专用色谱柱；柱温40℃；流速1mL/min；检测波长254nm；流动相A为乙腈、B为称取固体醋酸钠8.2g加水至1000mL，用醋酸调pH6.5，经过滤超声脱气10～15min后的制得物。

1.3.3 制备工艺

工艺流程：四角蛤蜊软体部→解冻→加水→匀浆→加NaCl，调pH，进行提取→过滤→提取液。

溶液中蛋白质测定[11]：紫外分光光度法，蛋白质质量浓度/(mg/mL)=1.45×A280－0.74×A260。

1.3.4 单因素试验

[12]并略作改动，试验选择的基本条件为料液比1:5 (m/V)、温度90℃、时间30min、加盐量和pH值不作调整。

1.3.5 提取条件的响应面法试验方案

表1 响应面设计试验因素与水平Table 1 Proximate chemical compositions of the soft part from Mactra veneriformis

在单因素试验的基础上，选择以提取温度、加盐量、pH值为影响因素，采用Design Expert 8.0软件按照中心组合原理[13]设计响应面试验方案，其相应的因素水平如表1所示。

2 结果与分析

2.1 原料的一般化学组成

四角蛤蜊软体部一般化学成分见表2。除水分外，粗蛋白质量分数最高，以干基计达60.14%，粗脂肪质量分数6.08%，仅为其十分之一，是高蛋白和低脂肪的水产食品原料。

表2 四角蛤蜊软体部一般化学组成Table 2 Proximate composition of the soft part of Mactra veneriformis

2.2 四角蛤蜊氨基酸组成测定结果

按1.3节方法中的氨基酸测定条件，得到标准品和样品氨基酸的分离图(图1)。

图1 标准品(a)与四角蛤蜊软体部(b)的氨基酸谱图Fig.1 Amino acid profile of the soft part from M. veneriformis

通过样品与标准品的出峰时间及峰面积比较，得到四角蛤蜊软体部氨基酸组成分析结果见表3。由表3可知，四角蛤蜊软体部分中除色氨酸外的9种必需氨基酸(包括半必需氨基酸)总量为18.94%，占总氨基酸的39.38%，6种呈味氨基酸[14](天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸)质量分数为22.73%，占总氨基酸的47.27%，比例较高，适合用于海鲜调味料的开发[15]。

表3 四角蛤蜊软体部氨基酸组成分析结果Table 3 Amino acid composition of soft part of M. veneriformis(dry base)

2.3 单因素试验

2.3.1 提取时间对蛋白质提取率的影响

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on protein recovery

由图2可知，在试验范围内提取时间对蛋白质提取率影响较小，提取率始终在34%～40%之间波动，选择15min较为合适。

2.3.2 提取温度对蛋白质提取率的影响

图3 提取温度对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on protein recovery

由图3可知，随着提取温度的增加，蛋白质提取率不断提高，这可能是软体部的蛋白质溶出随着温度的升高而增大的结果，当温度大于70℃时，提取率上升缓慢。

2.3.3 加盐量对蛋白质提取率的影响

图4 加盐量对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of NaCl amount on protein recovery

由图4可知，加盐量对蛋白质的提取率有显著影响，随着加盐量的增加，盐溶性蛋白不断溶出，当加盐量大于3%时，提取率开始下降，可能因为出现了盐析现象。

2.3.4 pH值对蛋白质提取率的影响

图5 pH值对蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of pH on protein recovery

由图5可知，当pH5左右时提取率为最低，可能因为其正好在蛋白质的等电点附近，蛋白质溶解度较小。随着pH值的升高，因其偏离等电点，提取率也在增加，但过碱则腥味很重，影响提取液食用性，故按相关文献[12]选定最高pH8进行研究。

2.4 响应面试验对提取条件的优化

2.4.1 响应面分析方案与结果

按照设计的响应面试验方案进行试验，得到的结果见表4。利用Design-Expert 8.0软件对表4试验数据进行多元回归拟合与方差分析，结果见表5、6。

由表5、6可以看出：模型P值为0.0008，失拟项P值为0.5275，表明模型显著，模型失拟不显著。回归方程的决定系数R2=0.9815，说明模型与实际情况拟合较好。所得的回归方程可表示为：提取率(Y)=51.18＋1.71A＋9.4B＋0.14C＋0.80AB－0.53AC－1.20BC－6.11A2－ 5.69B2－ 2.03C2。

表4 响应面设计方案与试验结果Table 4 Experimental design for response surface analysis and corresponding results

表5 响应面二次模型方差分析表Table 5 Variance analysis of the established response surface quadratic model

表6 模型分析表Table 6 Analysis of the established response surface quadratic model

2.4.2 因素间的交互作用

利用Design-Expert 8.0软件作响应面图，可直观地反映各因素交互作用对响应值的影响，见图6。比较图6的3个图可知，pH值对提取率的影响最为显著，曲线较陡，而温度与加盐量次之，相应表现为曲线较为平滑。

图6 各两因素交互作用对提取率的影响Fig.6 Response surface plots showing the effect of cross-interactions among three extraction conditions on protein recovery

2.5 最佳提取条件的确定

通过Design Expert 8.0软件分析，得到最佳提取条件为温度82.07℃、pH7.87、加盐量1.75%，此时提取率为55.42%。在此条件下进行验证实验测得提取率为54.78%，与理论值基本吻合。

3 结 论

四角蛤蜊软体部粗蛋白和粗脂肪质量分数以干基计分别为60.14%和6.08%，必需氨基酸占氨基酸总量的39.38%，呈味氨基酸占氨基酸总量的47.27%，是高蛋白、低脂肪、营养丰富、味道鲜美的食品原料。通过单因素试验和响应面方法对四角蛤蜊天然提取物制备工艺进行优化，得到的最佳工艺参数为温度82.07℃、pH7.87、加盐量1.75%，提取率为54.78%，可以为海鲜调味料等的研制开发提供参考。

参考文献：

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[2] 李永明, 国俭文, 王希芬, 等. 四角蛤蜊适宜盐度中最佳静水吐沙时间对比实验[J]. 中国水产, 2000(3): 48-49.

[3] 刘军海, 黄宝旭, 蒋德超. 响应面分析法优化艾叶多糖提取工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(2): 114-118.

[4] FRANCIS F, SABU A, NAMPOOTHIRI K M, et al. Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production ofα-amylase byAspergillus oryzae[J]. Biochemical Engineering Journal, 2003, 15(2): 107-115.

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[6] 杨文雄, 高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂, 2005(2): 68-71.

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[9] 刘希光, 于华华, 刘松, 等. 海蜇不同部位的氨基酸组成和含量分析[J]. 海洋科学, 2007, 31(2): 9-12.

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[15] 章超桦, 吴红棉, 洪鹏志, 等. 马氏珠母贝肉的营养成分及其游离氨基酸组成[J]. 水产学报, 2000, 24(2): 180-183.

Process Parameter Optimization for Extraction of Natural Extract fromMactra veneriformis

SHU Liu-quan，YI Xiao-lan，XU Wen-yuan，YAO Xing-cun
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

The proximate chemical composition and amino acid composition of the soft part fromMactra veneriformiswere analyzed. Based on dry weight, the contents of protein and lipid were 60.14% and 6.08%, respectively, and the content of 17 identified amino acids was determined to be 48.09%, and the content of essential amino acids (EAA) was 18.94% and of delicious amino acids (DAA) 22.73%, making up 39.38% and 47.27% of total amino acids, respectively. Natural extract(protein) extraction from the soft part fromMactra veneriformiswas performed by homogenization with water, pH adjustment and extraction with NaCl. Based on one-factor-at-a-time experiments, response surface methodology (RSM) was employed to optimize the preparation process. The optimal extraction conditions were extraction temperature of 82.07 ℃, pH 7.87 and NaCl concentration of 1.75%. Under these conditions, the protein recovery reached up to 54.78%.

Mactra veneriformis；composition；natural extract；response surface methodology (RSM)

TS254.4

A

1002-6630(2011)14-0156-05

2010-09-21

舒留泉(1966—)，男，副教授，硕士，研究方向为水产品加工与贮藏。E-mail：shulqhg@163.com