高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉中烟酰胺的不确定度评定
2011-10-27霍艳敏王艳丽周莉莉祝建华
霍艳敏，王艳丽，王 骏，周莉莉，祝建华，张 卉，薛 霞
(山东省产品质量监督检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心(山东)，山东 济南 250103)
高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉中烟酰胺的不确定度评定
霍艳敏，王艳丽，王 骏，周莉莉，祝建华，张 卉，薛 霞
(山东省产品质量监督检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心(山东)，山东 济南 250103)
建立高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉中烟酰胺不确定度的数学模型，并根据JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》和JJF 1059—1999《测量不确定度评定与表示》中的有关规定，逐层对乳粉中烟酰胺测量不确定度来源进行评估，最后给出合成标准不确定度和扩展不确定度；婴幼儿乳粉中烟酰胺测定结果为(63.01±3.50)mg/kg，k=2，p=95%。通过评定，提出影响检测结果的主要因素为样品前处理过程、标准溶液、标准曲线拟合等。
不确定度；烟酰胺；婴幼儿乳粉；高效液相色谱法
测量不确定度是表征合理地赋予被测量值的分散性、与测量结果相联系的参数[1]。测量不确定度的大小反映了测量结果质量的高低，并直接与检验结果的合格判定相关，因此完整的测量结果表示应该包括测量不确定度。烟酰胺是婴幼儿乳粉中重要的营养成分，它与蛋白质的代谢及儿童智力发育关系极大。GB2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》[2]规定烟酰胺在婴儿配方食品和较大婴儿和幼儿配方食品中的限量为3～26mg/100g。为了保证婴幼儿乳粉中烟酰胺的检测结果的准确性，本实验依据JJF 1059—1999《测量不确定度评定与表示》[1]和JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》[3]对烟酰胺测量过程不确定度的各个分量进行评价，并给出扩展不确定度，以期使该不确定度的给出可以作为改善烟酰胺测量程序，提高测量精密度和准确性的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品为市场随机抽查的婴儿奶粉。
烟酰胺标准品(纯度＞99.5%) 德国Dr. Ehrenstorfer公司；七氟丁酸 美国Alfa公司；甲醇(色谱纯)；磷酸二氢钾(分析纯)。
1.2 仪器与设备
2695高效液相色谱仪(二极管阵列检测器) 美国Waters公司；AB204-S电子天平(感量0.0001g) 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ5200超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；pHS型酸度计 上海伟业仪器厂。
1.3 样品处理
按照GB 5413.15—2010《食品安全国家标准：婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定》[4]进行。
1.4 色谱条件
色谱柱：Atlantis C18柱(25cm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇:50mmol/L磷酸二氢钾-0.4mmol/L七氟丁酸=5:95(V/V)[5]；流速：1.0mL/min；检测波长260nm；柱温：35℃；进样量：10μL。
1.5 烟酰胺质量分数计算
式中：X为样品中烟酰胺质量分数/(mg/kg)；c为由标准曲线得出的试样中烟酰胺的质量浓度/(mg/L)；m为样品质量/g；V为样品测试液定溶体积/mL；r为加标回收率。
2 结果与分析
2.1 不确定度的来源分析
从测量过程和数学模型分析，烟酰胺含量测定的不确定度主要来源于标准物质、标准物质工作曲线的拟合、样品称量、定容体积、样品的制备和测试过程的差异等几个方面[6-9]。
2.2 不确定度的评定
2.2.1 标准物质及配制过程引入的相对不确定度
2.2.1.1 标准物质引入的相对不确定度
根据标准物质证书提供的信息，烟酰胺的不确定度为0.5%，包含因子k＝2，属B类评定，其相对标准不确定度为：
2.2.1.2 标准溶液配制过程中引入的相对不确定度
(1) 标准物质称量引入的相对不确定度
标准储备液配制的过程是精确称取25.00mg烟酰胺标准物质，加水溶解并定容至25mL容量瓶。根据称量使用的电子天平检定证书，其最大允许误差0.5mg，重复性误差0.1mg，一般采用矩形分布，包含因子为，属B类评定。其标准不确定度为：
合成标准不确定度为：
(2) 标准溶液配制过程中玻璃器具校准引入的相对不确定度
标准工作液配制过程中使用了一系列玻璃器具，按照JJG 196—2006《常用玻璃量具检定规程》[10]的要求，均有相应的最大允差。按均匀分布处理，k＝计算不确定度分量。玻璃量具校准的不确定度见表1。
表1 标准溶液配制过程中玻璃器具校准引入的不确定度Table 1 Uncertainty resulting from the errors during the calibration of volumetric flasks and pipettes for standard solution preparation
由表1中的数据合成的相对不确定度为：
(3) 标准工作液配制过程温度变化引入的相对不确定度
玻璃器具在20℃进行校正，而实验室的温度一般为(20±5)℃，由温度波动引起的不确定度可通过估算温度范围和体积膨胀系数进行计算，液体的膨胀系数远高于玻璃的膨胀系数，所以玻璃的膨胀系数可忽略。标准工作液是用水稀释配制，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，计算标准不确定度时，假设温度变化为矩形分布，即k＝。
表2 标准溶液配制过程中温度变化引入的不确定度Table 2 Uncertainty resulting from temperature change during standard solution preparation
由表2数据合成的相对标准不确定度为：
因此，由标准物质本身、天平、玻璃器具校准和温度变化的不确定度分量合成标准溶液的相对标准不确定度为：
2.2.2 标准工作曲线拟合引入的相对不确定度
配制质量浓度分别为0.995、2.49、4.98、9.95μg/mL的烟酰胺标准使用溶液，每个质量浓度水平平行测量3次，用最小二乘法拟合标准溶液质量浓度-峰面积曲线，标准曲线数据见表3。
根据表3数据，采用最小二乘法拟合标准曲线，得曲线方程为：y＝1.53×104x－1.55×103(式中，y为峰面积、x为烟酰胺含量、b＝1.53×104、a＝1.55×103，相关系数为0.9998)。
乳粉样品经测定6次后，由线性方程得到测试液中烟酰胺质量浓度(c)为2.510μg/mL，由拟合曲线求c时产生的标准不确定度为：
式中：SR为从标准曲线求得的峰面积Y与相应测得的峰面积Yi之差所求出的标准偏差；m为样品溶液的测定总次数，此处m为6；n为标准溶液的测定总次数，此处n为12；c为样品中烟酰胺质量浓度的平均值；c0为标准溶液中烟酰胺质量浓度的平均值：ci为标准溶液中烟酰胺的质量浓度。
2.2.3 乳粉重复测定引入的相对不确定度
表4 乳粉样品重复测定结果Table 4 Replicate determination results of nicotinamide in infant formula milk powder
乳粉样品重复测定6次，结果见表4。通过重复测量样品进行评定，它包含试样前处理过程、使用器皿、仪器及进样量的不确定度，根据JJF 1135—2005的规定，该不确定度属A类评定。所测结果X平均值的标准不确定度uX采用平均值的标准偏差s(X)表征。计算公式如下：
2.2.4 样品前处理过程引入的相对标准不确定度
2.2.4.1 样品称量引入的相对不确定度
称取2.0g(精确到0.0001g)样品，由此引起的相对不确定度为：
2.2.4.2 样品定容引入的相对不确定度
样品经过处理使用50mL容量瓶定容，其最大允许误差为±0.05，按均匀分布，容量瓶检定的标准不确定度为。因容量瓶在使用和校准时存在温度波动，一般为±5℃，按均匀分布，由此产生的不确定度为5×50×2.1×10-4÷ 3÷50＝6.06×10-4。
由定容体积引入的相对标准不确定度为：
2.2.4.3 添加回收率引入的相对不确定度[11]
样品前处理过程中烟酰胺存在损失，通过样品添加烟酰胺计算回收率，5次样品添加回收率的结果分别为92.3%、92.0%、98.1%、98.3%、102.0%，平均回收率为r=96.54%，标准偏差s为00.043，标准不确定度采用平均值的标准偏差，标准不确定度为：
为了确定回收率是否归入烟酰胺质量分数数学模型的计算中，需对回收率进行显著性检验：
结果P＝0.95、f＝4时，t0.05,4=2.78。由于t＜t0.05,4，说明r与1无显著差异，r值不必使用。
因此，由样品处理过程产生的相对不确定度为：
2.2.5 分析仪器引入的相对标准不确定度
该高效液相色谱仪的定量重复性(以RSD表示)为1.1%，测定值一般为对称分布，则：
2.3 乳粉中烟酰胺质量分数的相对标准不确定度来源汇总
表5 乳粉中烟酰胺质量分数的相对标准不确定度来源汇总表Table 5 List of relative standard uncertainties for nicotinamide determination of infant formula milk powder
根据2.2节结果得到乳粉中烟酰胺质量分数的相对标准不确定度来源见表5。
2.4 合成标准不确定度
根据前述结果，得到高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉中烟酰胺的不确定度为：
2.5 扩展不确定度
依据JJF 1135—2005，对于大多数测量，采用置信概率p＝95%、包含因子k=2衡量，则扩展不确定度为u＝uf×2＝3.50mg/kg。
3 结 论
通过对影响乳粉中烟酰胺测定不确定度各分量的评价，可见测定过程中对不确定度贡献最大的是样品前处理过程、标准溶液配制及标准曲线的拟合过程，今后应在这几方面加以改进，以进一步提高检测质量。婴幼儿乳粉中烟酰胺测定结果为(63.01±3.50)mg/kg，k＝2，p＝95%。
[1] JJF 1059—1999测量不确定度评定与表示[S].
[2] GB 2760—2007食品添加剂使用卫生标准[S].
[3] JJF 1135—2005化学分析测量不确定度评定[S].
[4] GB 5413.15—2010婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定[S].
[5] 刘娜, 陈大舟, 汤桦, 等. 婴儿配方奶粉中8种水溶性维生素的高效液相色谱同时测定[J]. 分析测试学报, 2008, 27(4): 408-411.
[6] 蔡秋, 朱明. 高效液相色谱法测定茶饮料中苯甲酸结果不确定度评定[J]. 食品科学, 2007, 28(2): 277-280.
[7] 杨洋, 徐春祥, 车文军. 高效液相色谱法测定乳粉中的三聚氰胺及其不确定度分析[J]. 食品科学, 2010, 31(4): 250-253.
[8] 戚荣平. 高效液相色谱仪测定酱油中苯甲酸的不确定度[J]. 浙江预防医学, 2006, 18(2): 封三-封四.
[9] 汪辉, 曹小彦, 胡朝晖. 高效液相色谱法测定小麦粉与大米粉中甲醛次硫酸氢钠含量的不确定度评定[J]. 食品科学, 2009, 30(12): 205-208.
[10] JJG 196—2006常用玻璃量器检定规程[S].
[11] 严凤, 张文刚, 李丹妮. 液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中氯霉素残留量不确定度分析[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2008(5):32-33.
Uncertainty Evaluation for Nicotinamide Determination in Infant Formula Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography
HUO Yan-min，WANG Yan-li，WANG Jun，ZHOU Li-li，ZHU Jian-hua，ZHANG Hui，XUE Xia
(National Center for Quality Supervision and Inspection of Processed Food (Shandong), Shandong Supervision and Inspection Institute for Product Quality, Jinan 250103, China)
A mathematical model was established to evaluate the uncertainty of determining nicotinamide in infant formula milk powder by high performance liquid chromatography with diode-array detection. According to the relevant regulations given in JJF 1135-2005Evaluation ofUncertaintyinChemical Analysis Measurementand JJF 1059－1999EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement, the sources of uncertainty for determining nicotinamide in infant formula milk powder were explored. Finally, the standard uncertainty and the expanded uncertainty were achieved. The content of nicotinamide in infant formula milk powder determined by HPLC was (63.01 ± 3.50) mg/kg. The major sources of uncertainty affecting determination results were pre-treatment, standard solution and standard curve fitting.
uncertainty；nicotinamide；infant formula milk powder；high performance liquid chromatography(HPLC)
O657.72
A
1002-6630(2011)16-0330-04
2010-11-10
霍艳敏(1981—)，女，工程师，硕士，研究方向为食品检测。E-mail：huoyanmin0628@163.com
