响应面分析法优化怀地黄中梓醇提取工艺

徐定华，朱文学*

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)

响应面分析法优化怀地黄中梓醇提取工艺

徐定华，朱文学*

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)

目的：优化回流辅助提取怀地黄中的梓醇工艺。方法：在单因素试验基础上，采用响应面法，以梓醇的提取得率为响应值，通过回归分析各工艺参数与响应值之间的关系，并由此预测最佳的工艺条件。结果：回流提取的最佳条件为甲醇体积分数72.94%、提取温度54.8℃、料液比(g/mL)1:18.7、提取时间3.0h。该条件下提取2次，梓醇的提取得率达到3.513%。结论：响应面法优化回流辅助提取怀地黄中梓醇的预测准确、方便，所得的最佳提取工艺条件高效、可行。

怀地黄(Rehmannia glutinosaLibosch)为玄参科植物地黄的新鲜或干燥块根，始见于《神农本草经》，是我国著名的“四大怀药”之一。据统计它在中药处方中的使用频率排名处于前10位[1-2]。根据入药形式及药效的差异，可将地黄分为鲜地黄、生地黄、熟地黄。

梓醇是一种环烯醚萜苷类物质，是鲜地黄及生地黄的主要有效成分之一，具有利尿、缓泻、降血糖、保肝、保护神经、抗肝炎病毒以及抗癌及抗衰老等多种药理活性[3-6]。目前，梓醇多是从天然植物中提取经高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)纯化而制得[7]，生产成本较高，还没有规模生产的相关报道。由于梓醇化学性质不稳定[8]，易受酸碱[9-10]等条件影响，提取比较困难。在怀地黄产地，通常是选取比较粗大的块根经烘焙制成生地黄及炮制成熟地黄作为药用[11]，而细小和破碎部分由于没有烘焙价值，大部分都弃掉，造成了资源的巨大浪费。因此本实验拟在单因素试验基础上，利用响应面分析法(response surface methodology，RSM)对怀地黄梓醇提取工艺条件进行优化。以期为地黄的综合开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

怀地黄 河南省温县赵堡乡军地滩村怀地黄种植基地。

梓醇标准品(批号：20085118) 中国药品生物制品检定所；甲醇、磷酸(均为分析纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯) 天津市四友精细化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100型高效液相色谱仪、Agilent 1100型紫外检测器、DAD检测器、Agilent色谱工作站 美国Agilent公司；FA1004型分析天平(万分之一) 上海市上平仪器公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市英峡予华仪器厂；FW177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；平行蒸发仪 广州尚准仪器有限公司；旋涡式样品混合器 美国ABSON公司；101A-2型数显电热鼓风干燥箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梓醇 HPLC法检测

1.3.1.1 色谱条件

色谱柱：C18柱(Hypersil，250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(1:99)；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm；进样量：10μL。

1.3.1.2 梓醇标准曲线的绘制

准确称取0.0041g梓醇标准品，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀，得0.41mg/mL标品储备液。再从此储备液中取5mL，在平行蒸发仪上浓缩至干，用流动相复溶。准确吸取该对照品液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用流动相定容于1mL样品瓶中。

上述配制好的标准溶液系列，以1.3.1.1节色谱条件进行测定，以梓醇含量为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为：Y＝3.3696X＋0.1088，R2＝ 0.9995。

1.3.2 样品处理及含量测定

将鲜怀地黄切成2～3mm小块，磨碎，过100目筛，精密称定筛下物2.00g于平底烧瓶中，加80%甲醇40mL，于50℃水浴回流提取2h，过滤；将滤渣转移至平底烧瓶中，加80%甲醇40mL，同上法操作，合并续滤液，定容到100mL容量瓶中。精密吸取上液20mL，减压浓缩，挥去溶剂，用流动相复溶，定容至5mL；用0.45μm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱测定含量。根据测得的峰面积，利用标准曲线计算样品中梓醇含量，用下式可得到怀地黄梓醇的提取得率。此鲜怀地黄的湿基含水率为72.39%。

式中：W为地黄梓醇提取得率/%；m为样品中梓醇含量；F为稀释因子；G为怀地黄干粉的质量。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

回流提取过程中主要影响因素有溶剂体积分数、提取温度、液料比和提取时间等。为了考察各因素对提取效果的影响，以溶剂体积分数(20%、40%、60%、80%、100%)、提取温度(30、40、50、60、70℃)、料液比(g/mL)(1:5、1:10、1:15、1:20、1:25)和提取时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)作为考察因素，以W作为试验指标，进行单因素试验。

1.4.2 怀地黄梓醇提取工艺的优化

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理，以溶剂体积分数、提取温度、料液比和提取时间为考察变量，分别用A、B、C、D表示，以W为响应值，采用4因素5水平响应面分析方法求取优化的工艺参数。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂和提取次数的确定

根据梓醇的性质，选择提取梓醇最常用的乙醇、甲醇、水3种溶剂，在60℃水浴上回流提取2次，每次2h的条件下，分别测定梓醇的提取得率。试验结果表明，甲醇体系的提取得率远高于乙醇和水体系的提取，故选用甲醇做提取溶剂。

用甲醇做提取溶剂，在60℃水浴上分别对同一怀地黄样品提取1、2、3次，结果表明，提取2次的得率远高于提取1次的，而和提取3次的差别不大，综合考虑成本等因素，本试验确定提取次数为2次。

2.2 单因素试验

2.2.1 溶剂体积分数

称取2.00g磨碎的鲜怀地黄样品，调节料液比为1:20，分别用20%、40%、60%、80%、100%甲醇在50℃水浴回流提取2h，同法提取2次，结果如图1所示。

图1 溶剂体积分数对梓醇提取得率的影响Fig.1 Effect of methanol concentration on catalpol extraction yield

由图1可知，随着溶剂体积分数的增大，W增大，当溶剂体积分数达到80%时，W达到最大；主要是因为甲醇体积分数不同，极性不同，故梓醇的溶出率不同；溶剂体积分数继续增大，W开始减小，因此选定在60%～100%区间内作响应面优化。

2.2.2 提取温度

称取2.00g磨碎的鲜怀地黄样品，调节料液比为1:20，用80%的甲醇分别在30、40、50、60、70℃水浴上回流提取2h，同法提取2次，结果如图2所示。

图2 提取温度对梓醇提取得率的影响Fig.2 Effect of temperature on catalpol extraction yield

由图2可以看出，随着温度的升高，W增大，温度从40℃升到50℃时，W明显增大；随着温度的进一步升高，W下降，说明梓醇是一种热敏性物质，在高温下不稳定。因此选定在40～60℃区间内作响应面优化。

2.2.3 料液比

称取2.00g磨碎的鲜怀地黄样品，调节料液比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，用80%甲醇分别在50℃水浴上回流提取2h，同法提取2次，结果如图3所示。

图3 料液比对梓醇提取得率的影响Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on catalpol extraction yield

由图3可以看出，随着提取溶剂用量的增大，W增大，料液比从1:15到1:20时，W明显增大；提取溶剂用量继续增大时，W升高不明显，综合考虑提取成本等因素，选定在1:10～1:30区间内作响应面优化。

2.2.4 提取时间

称取2.00g磨碎的鲜怀地黄样品，调节料液比为1:20，用80%甲醇分别在50℃水浴上分别回流提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，结果如图4所示。

由图4可以看出，随着提取时间的增长，W增大，提取时间从2.0h增长到3.0h时，梓醇提取得率明显增大；可能是因为时间过短，梓醇还未充分溶出；提取时间继续增长时，W升高不明显，因此选定在1.5～3.5h区间内作响应面优化。

图4 提取时间对梓醇提取得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on catalpol extraction yield

2.3 响应面优化试验

2.3.1 Box-Behnken响应面试验

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，结合上述单因素分析结果，以上面4个因素为自变量，以梓醇提取得率(Y)为响应值，具体试验设计方案[12]和结果见表1、2。

表1 怀地黄梓醇提取工艺响应面试验因素水平编码值Table 1 Factors and their coded levels in Box-Behnken experimental design

2.3.2 模型的建立与显著性检验

采用SAS9.2软件[13]对试验结果进行二次多元回归分析，得到怀地黄中梓醇的提取得率与回流提取各因素变量间的函数关系为：Y=3.493571－0.034625A＋0.108125B＋0.018708C＋0.040458D－0.006813AB＋0.000812AC－0.024812AD－0.015813BC＋0.023312BD＋0.009687CD－0.047632A2－0.058882B2－0.090132C2－0.042632D2。

对表2试验结果进行统计分析，得到的方差分析结果如表3所示。

由表3可知，4个一次项均达到极显著水平。由F值可知，各因素对W的影响次序为：B＞D＞A＞C。从表3的分析结果来看，整体模型的P值小于0.0001，表明该二次方程模型达到极显著水平。二次项及交互项中的AD、BC、BD均表现出显著水平。回归方差分析显著性检验结果表明，该模型回归极显著，并且失拟项不显著，说明该方程对试验拟合较好[14-16]。

表2 怀地黄梓醇提取工艺响应面试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental results

表3 回归方程方差分析表Table 3 Variance analysis of the established regression equation

2.3.3 响应面分析

固定水平：料液比1:20；提取时间2.5h。

图6 溶剂体积分数与料液比对梓醇提取得率的影响Fig.6 Response surface plot slowing the effects of methanol concentration and solid-to-liquid ratio on liquid on catalpol extraction yield

图7 溶剂体积分数与提取时间对梓醇提取得率的影响Fig.7 Response surface plot slowing the effects of methanol concentration and extraction time on catalpol extraction yield

为了考察交互项对梓醇提取得率的影响，在其他因素条件固定不变的情况下，考察交互项对提取得率的影响，对模型进行降维分析。经SAS9.2软件分析，所得的响应面分析图见图5～10。响应面分析图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响。

由图5～10可知，随着各因素量的增大，响应值增大；当响应值增大到极值后，随着因素量的增大，响应值逐渐减小；在交互项对提取率的影响中，溶剂体积分数与提取时间、提取温度与料液比、提取温度与提取时间对W的影响较显著。另外，由图5～10可知该模型在实验范围内存在稳定点，且稳定点是最大值。

图8 提取温度与料液比对梓醇提取得率的影响Fig.8 Response surface plot slowing the effects of temperature and solid-to-liquid ratio on catalpol extraction yield

图9 提取温度与提取时间对梓醇提取得率的影响Fig.9 Response surface plot slowing the effects of extraction temperature and time on catalpol extraction yield

图10 料液比与提取时间对梓醇提取得率的影响Fig.10 Response surface plot slowing the effects of solid-to-liquid ratio and extraction time on catalpol extraction yield

2.3.4 响应面分析

为进一步确定提取工艺最佳点，对拟合的回归方程分别求4个变量的一阶偏导，联立方程组。对上方程组求解，并结合响应面图中的评价，可得到怀地黄中梓醇最佳提取工艺参数为：甲醇体积分数72.94%、提取温度54.8℃、料液比1:18.7、提取时间3.0h，在此最佳工艺条件下怀地黄梓醇理论提取得率为3.513%。考虑到可操作性，在提取条件为甲醇体积分数73%、提取温度55℃、料液比1:19、提取时间3.0h时，进行验证实验，得到怀地黄梓醇的提取得率为3.509%，与理论值较为接近，表明数学模型对优化怀地黄梓醇的提取工艺可行。

3 结 论

在怀地黄梓醇的提取体系中，选择甲醇为提取溶剂，通过单因素试验和Box-Behnken试验设计以及响应面分析对回流提取工艺进行优化，得出较优工艺条件：甲醇体积分数72.94%、提取温度54.8℃、料液比1:18.7、提取时间3.0h。在较优的提取条件下，怀地黄梓醇的提取得率可达到3.509%。并得到回流提取工艺中各因素变量的二次方程模型，该模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定应用价值。

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Response Surface Methodology as an Approach to Optimize Catalpol Extraction fromRadix Rehmannia glutinosa

XU Ding-hua，ZHU Wen-xue*
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Objective: To optimize the process parameters of solvent reflux extraction of catalpol fromRadix Rehmannia glutinosa. Methods: On the basis of one-factor-at-a-time experiments, response surface methodology (RSM) was used for process parameter optimization. A regression model was established describing catalpol extraction yield as a response to various process parameters. Results: The optimal extraction conditions were 72.94% methanol aqueous solution as the extraction solvent,extraction temperature 54.8 ℃, extraction time 3.0 h and number of repeated extractions 2. Under these conditions, the catalpol extraction yield was 3.513%. Conclusion: The established regression model can accurately and conveniently predict catalpol extraction yield. The optimal extraction process obtained is efficient and feasible.

Rehmannia glutinosaLibosch；catalpol；extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0062-05

2010-10-21

徐定华(1978—)，女，硕士研究生，主要从事天然产物开发与利用研究。E-mail：xudinghua2008@126.com

*通信作者：朱文学(1967—)，男，教授，博士，主要从事农产品与中草药加工研究。E-mail：zwx@mail.haust.edu.cn