南五味子叶绿体DNA的提取

湘潭职业技术学院 李 君 李俊雅

河南羚锐制药股份有限公司 袁德先

南五味子叶绿体DNA的提取

湘潭职业技术学院 李 君 李俊雅

河南羚锐制药股份有限公司 袁德先

随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphic DNA，RAPD）是在DNA水平上进行遗传标记的常用分析方法之一。在操作过程中，DNA的提取质量是影响实验结果最为关键的因素。本文，笔者在对五味子进行分子生物学研究时发现南五味子叶中多酚、多糖、蛋白质等复杂的次生、初生代谢物质，给叶绿体DNA提取造成很大的影响。因此，本文，笔者对传统的叶绿体DNA提取方法进行了改良，对南五味子叶绿体DNA的提取方法进行了研究，在确定有效的提取方法并获得高质量的叶绿体DNA后，为下一步优选适合的RAPD条件创造了条件。

一、材料与试剂

1.实验材料。南五味子叶片由贵州GAP基地提供，叶片临用前先用去离子水浸泡，使其变软，展开，洗去表面灰尘，然后用酒精棉球擦拭其表面，以达到灭菌的目的，防止外源性DNA的污染，晾干或用吸水纸吸干备用。

2.试剂。液态氮，PVP（聚乙烯基吡咯烷酮），提取缓冲液A（50mmol/L Tris-HClpH=3.6，25mmol/L EDTA，1.25mol/L NaCl），提取缓冲液B（50mmol/LTris-HClpH=3.6，25mmol/L EDTA，1.25mol/LNaCl，10mmol/Lβ-巯基乙醇），提取缓冲液C（0.15mol/LNaCl，100mMEDTApH=8.0），提取缓冲液D（50mmol/LTris-HClpH=8.0，25mMEDTA），提取缓冲液E（0.35mol/L 山 梨 醇 ，100mmol/L Tris-HClpH=8.0，5mM EDTA），β-巯基乙醇，MgCl2（1mol/L），10%SDS（十二烷基磺酸钠），10%十二烷基肌氨酸钠，蛋白酶K。以上Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）、蛋白酶K及RNaseA（核糖核酸酶A）均为上海生工试剂，其他为市售分析纯。UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒（SK1203，Sangon）。

二、实验方法

在常规的叶绿体DNA提取方法的基础上进行方法学考察。

1.常规的叶绿体DNA提取方法。取干燥叶片1.5～2g，4℃暗处理过夜，冲洗干净，吸干水分，去中脉，剪碎后置匀浆器中，加入5倍体积4℃预冷的缓冲液A，匀浆；用8～10层无菌细布过滤，滤液于4℃ 2500r·min-1离心10min；弃去上清液；沉淀加入10ml缓冲液B（其中10mmol/Lβ-巯基乙醇用前加入），轻轻悬浮，4℃ 2500r·min-1离心8min；弃上清，沉淀（可用缓冲液B再洗一次）用少量5ml缓冲液C悬浮沉淀，4℃下4000rpm离心10min，此沉淀即为纯化的叶绿体。

上述叶绿体沉淀加入50μg蛋白酶K（20mg/ml）和10%的SDS2ml，37℃保温2h；用等体积的氯仿：异戊醇（24∶1）抽提3次，上清液加1/10体积0.2mol/LNaAc和2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置过夜；10000rpm离心30min收集沉淀，20ml 70%乙醇冲洗一遍，室温放置15min，12000rpm离心10min，风干，溶于1000μlTE，加入1/100体积的5mg/mlRNA酶，37℃保温0.5h；再加1/200体积蛋白酶K（10mg/ml），继续保温1h；氯仿：异戊醇（24∶1）抽提后，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗，真空抽干，用50μl去离子水溶解DNA沉淀，-20℃冰箱保存。

2.方法学考察。在常规提取方法基础上进行改进，见图1。

方法1。样品加入10%PVP粉末，在研钵中加提取缓冲液A研磨。

方法2。纯化的叶绿体沉淀加入2.5ml缓冲液B（无β-巯基乙醇），19μlDNaseI，1mlMgCl2（1mol/L）冰浴1h，后加200μl EDTA终止反应，离心，弃上清。

方法3。用少量5ml缓冲液C悬浮沉淀，离心，弃上清后加入冷藏的提取缓冲液E悬浮沉淀，冰上放置10min，离心，弃去上清液，沉淀即为纯化的叶绿体。

方法4。加入10ml缓冲液D悬浮,加1/20体积10%十二烷基硫酸钠（SDS），l/5体积10%十二烷基肌氨酸钠及1/200体积10mg/ml蛋白酶K，充分摇匀，37℃保温3h，其间不断轻轻摇匀，其余同常规的方法。

方法5。加入10ml缓冲液D悬浮,加1/20体积10%十二烷基硫酸钠（SDS），l/5体积10%十二烷基肌氨酸钠1/200体积10 mg/ml蛋白酶K，充分摇匀，37℃保温3h，其间不断轻轻摇匀，其余同常规的方法。

方法6。综合方法1、2、3和5，余下步骤同常规的提取方法。

方法7。同方法6，接下来用UNIQ-10柱处理，-20℃冰箱保存。

根据试验结果，确定南五味子叶绿体DNA的提取方法：

称取硅胶快速干燥的叶片1.5～2g，4℃暗处理过夜，冲洗干净，吸干水分，去中脉，剪碎后置研钵中，加入10%的PVP粉末和冷藏的提取缓冲液A研磨；用8～10层无菌细布过滤，滤液于4℃ 2300r·min-1离心10min；弃去上清液；沉淀加入10ml缓冲液B（其中200μL10mmol/Lβ-巯基乙醇用前加入），轻轻悬浮，4℃ 2300r·min-1离心8min；弃上清，沉淀可用缓冲液B再洗一次；加2.5ml缓冲液B（无β-巯基乙醇），19μlDNaseI，1mlMgCl2（1mol/L）冰浴1h，后加200μlEDTA终止反应，离心，弃上清；加入冷藏的提取缓冲液E，冰上放置10min，4℃，3000r/min离心10min，弃上清，沉淀即为纯化的叶绿体，并用分光光度计测量上清液；加入10ml缓冲液D悬浮,加1/20体积10%十二烷基硫酸钠（SDS），l/5体积10%十二烷基肌氨酸钠，1/200体积10mg/ml蛋白酶K及100μlβ-巯基乙醇，充分摇匀，37℃保温3h，其间不断轻轻摇匀；用等体积的氯仿：异戊醇（24∶1）抽提3次，上清液加1/10体积0.2mol/LNaAc和2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置过夜；12000rpm离心15min收集沉淀，70%乙醇冲洗一遍，室温放置15min，12000rpm离心10min，风干，溶于1000μlTE；加入1/ 100体积的5mg/mlRNA酶，37℃保温0.5h；加1/200体积蛋白酶K（10mg/ml），继续保温1h；氯仿：异戊醇（24∶1）抽提后，乙醇沉淀，70%乙醇洗，真空抽干，用50μl去离子水溶解cpDNA沉淀；保存于-20℃冰箱保存。

三、结果与分析

高质量的DNA模板是RAPD成功的关键因素之一，因此选用最佳的叶绿体DNA提取及纯化方法是实验成功的根本保证。

电泳检测：取10μlcpDNA提取物，在1.2%的琼脂糖凝胶上用1×TAE电泳缓冲液电泳，0.5ng/mlEB染色，紫外检测，拍照。紫外检测结果见图2。

四、讨论

1.目前对叶绿体DNA的提取多采用蔗糖梯度离心等方法，所提取的叶绿体DNA纯度高无降解是做RAPD等分子标记的理想方法，但本文笔者提取叶绿体DNA的方法其效果同样非常理想。所提取cpDNA在纯度完整性上都可以满足RAPD的要求。

2.在提取cpDNA中分别采用了硅胶快速干燥的材料和新鲜的材料，提取结果显示新鲜材料纯度高、无降解，而快速干燥的样品则有少许降解现象，所以cpDNA提取最好使用新鲜材料。本实验选择了采用硅胶快速干燥的叶片提取效果较好，而且采集叶片的方法简单易行，比较适合实验研究。

3.在提取之前先对叶片进行暗处理和洁净处理，能够消耗一部分糖类并有效地避免外源性DNA的污染。在分离叶绿体时，于2300r/min离心，目的是尽量减少细胞核，但同时保证尽量多的完整叶绿体。