3，4，5-三羟基苯甲酸印迹聚合物的分子识别特性

张铁莉

（唐山师范学院 化学系，河北 唐山 063000）

分子印迹聚合物（MIP）对目标分子具有高度的选择性，具有仿生抗体之美喻，是用化学方法合成的大分子受体[1]，在固相萃取、传感器、催化反应等领域已展现了广泛的应用前景[2-4]。目前，尽管采用非共价印迹技术已经成功制备了多种化合物的印迹聚合物，但是制备出高分子识别能力的MIP并非易事。为了更好地阐明分子印迹及识别机理，研究模板分子的结构对 MIP分子识别性质的影响，对于高亲和力和高选择性 MIP的制备具有重要的理论指导意义。本课题组[5]曾制备了羟基数目及位置不同的羟基苯甲酸化合物的印迹聚合物，研究了模板分子中作用基团的数目及位置对非共价 MIP印迹效应的影响。本文对其中印迹效果最好的3，4，5-三羟基苯甲酸（3，4，5-THBA）印迹聚合物进行了Scatchard分析，得到了其结合特性参数。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Shimadzu UV-265紫外可见分光光度计（日本岛津公司），1cm石英吸收池；HY-2A调速多用振荡器（江苏常州国华仪器厂）；其他同文献[5]。

1.2 聚合物的合成

将 1mmol(188 mg) 3，4，5-THBA（含一个分子结晶水，模板）、6mmol（427 mg）丙烯酰胺（功能单体）、30mmol （5.7 mL）乙二醇二甲基丙烯酸酯（交联剂）和30mg偶氮二异丁腈（引发剂）加入到180×18mm硬质玻璃试管中，溶于10mL乙腈（MeCN），通 N210min，液氮条件下真空封管，60°C水浴中反应24h。将所得聚合物破碎、研磨、过筛，用丙酮反复沉降聚合物颗粒，倾泻法除去过细的粉末，得到粒径小于 30μm 的印迹聚合物 P(3，4，5-THBA)颗粒。60°C 真空干燥，放入保干器中备用。空白聚合物BP的制备除不加模板外，制备和处理步骤同上。

1.3 色谱法评价聚合物的分子识别性能

按照文献[5]方法，测定各实验化合物BA（Benzoic acid）、SA（Salicylic acid）、3-HBA（3-Hydroxybenzoic）、4-HBA（4-Hydroxybenzoic acid）、2，4-DHBA（2，4-Dihydroxybenzoic acid）、3，4-DHBA（3，4-Dihydroxybenzoic acid）、GA（Gentisic acid）、3，4，5-DHBA（3，4，5-Trihydroxybenzoic acid）、CAT（Catechol）、RH（Rhein）的保留时间并计算容量因子k’。

1.4 Scatchard 方法研究 P(3，4，5-THBA)的结合特性

首先以HAc/CH3OH=2/8(V/V)溶液为洗脱液，用索氏提取法将聚合物中的模板以及未反应的功能单体、交联剂等从P(3，4，5-THBA)中洗出（紫外监测），再用甲醇洗去聚合物中残留的 HAc（紫外监测），然后在 60°C下真空干燥。称取干燥的P(3，4，5-THBA)30mg，置于10mL具塞磨口锥形瓶中，加入3.0mL浓度c为0～2.5 mmol/L的3，4，5-THBA乙腈溶液，室温振荡10h，转入5mL具塞离心试管中，以6000rpm转速离心 10min。取适量离心液用乙腈稀释至一定体积，在268nm波长下测定其吸光度，求出溶液中3，4，5-THBA的平衡浓度[3，4，5-THBA]。根据吸附前后溶液中 3，4，5-THBA 浓度的变化值，计算P(3，4，5-THBA)对3，4，5-THBA的吸附量Q。以Q对3，4，5-THBA的初始浓度c作图，则得到吸附等温线；以Q/[3，4，5-THBA]对Q作图，则得到Scatchard图，计算解离常数和结合位点数。

2 结果与讨论

2.1 P(3，4，5-THBA)的分子识别性能

图1为在不同H2O含量（1～3%H2O）的乙腈流动相中，采用色谱法测定得得 P(3，4，5-THBA)及 BP对各实验化合物的保留值。由图1可知：（1）在实验的不同H2O含量的乙腈流动相中，3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的保留值均显著大于其在 BP上的保留值，说明 P(3，4，5-THBA)对3，4，5-THBA 具有显著的印迹效应。（2）随着流动相中 H2O含量的增大，3，4，5-THBA及其他各实验化合物的k’均减小。这是由于 H2O有很强的氢键形成能力，能与实验化合物竞争结合聚合物上的酰胺基团的缘故。这反映了在 P(3，4，5-THBA)的结合过程中，氢键结合起了十分重要的作用。

图1 乙腈中水含量对P(3，4，5-THBA)和BP结合能力的影响

2.2 混合物的色谱分离

在印迹聚合物和空白聚合物上，模板化合物及其结构类似物混合物溶液分离的色谱图，可以直观地反映印迹聚合物分离能力的提高。图 2是 3，4-二羟基苯甲酸（3，4-DHBA）和 3，4，5-THBA 混合物溶液在 P(3，4，5-THBA)和 BP 上分离的色谱图。

图 2 3，4-DHBA 和 3，4，5-THBA 在 BP 柱（A）和P (3，4，5-THBA)柱（B）上分离的色谱图

流动相：H2O/MeCN =1.5/98.5（V/V）；流速：1.6 mL/min；检测波长：260nm；组分浓度：0.5mmol/L；进样体积：100μL

由图 2可见，此二组分在 BP上只能部分分离，而在P(3，4，5-THBA)上二者几乎达到了基线分离。这说明由于这两种化合物在 BP上非特异性结合能力的差异，BP对其也有一定的分离能力；但由于 3，4，5-THBA 的印迹效应，P(3，4，5-THBA)对其有更好的分离能力。同时也可看到3，4-DHBA 和 3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的色谱峰均显著展宽并有拖尾，说明 P(3，4，5-THBA)上的结合位点是不均匀的。这一点在P(3，4，5-THBA)的结合特性研究中（2.3）得到了进一步证实。非共价印迹聚合物结合位点的多抗性是其用于色谱分离时，色谱柱柱效不高的重要原因，也是其用于HPLC时存在的主要问题。

2.3 Scatchard 方法研究 P(3，4，5-THBA)的结合特性

为了测定 P(3，4，5-THBA)对 3，4，5-THBA 的结合特性参数，在3，4，5-THBA的浓度为0～2.5mmol/L范围内，用平衡结合法测定了 P(3，4，5-THBA)对 3，4，5-THBA 的结合等温线（图 3）。P(3，4，5-THBA)对 3，4，5-THBA 的结合量 Q 随 3，4，5-THBA初始浓度的增大而增大，并且在实验测定的浓度范围内未达到饱和。这是由于聚合物中存在随初始浓度线性增加的非特异性吸附作用，致使 P(3，4，5-THBA)的吸附等温线很难达到饱和，这一结果与生物大分子受体类似，与文献[6]报道的情况类似。

图 3 3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的吸附等温线

根据 Scatchard 方程[6]，可以得到 P(3，4，5-THBA)的结合特性参数。Scatchard方程：

Q/[3，4，5-THBA]=(Qmax-Q)/KD

式中，Q 是 P(3，4，5-THBA)对 3，4，5-THBA 的结合量，Qmax是最大表观结合位点数，KD是离解常数，[3，4，5-THBA]是3，4，5-THBA 的平衡浓度。在所研究的浓度范围内，以Q/[3，4，5-THBA]对 Q 作图，得到两条直线（图 4），其线性回归方程分别为：

Q/[3，4，5-THBA]=125.3-4.098Q（R2=0.997）

Q/[3，4，5-THBA]=39.61-0.4339Q（R2=0.921）

图 4 3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的 Scatchard 图

这表明 P(3，4，5-THBA)中存在两类结合位点。由直线的斜率和截距可分别求得高、低亲和力结合位点的离解常数和最大结合位点数。高亲和力结合位点的离解常数 KD1=2.4×10-4mol/L，最大结合位点数Qmax1=30.6μmol/g；低亲合力结合位点的离解常数 KD2=2.3×10-3mol/L，最大结合位点数 Qmax2=91.1μmol/g。

多数非共价分子印迹聚合物具有不均匀的结合位点[6]，主要影响因素有两个[7]：（1）由于印迹聚合物的形态不规则，使得识别位点不一致，识别位点可能位于交联密度及可接近性不同的聚合物链上，这与制备多克隆抗体类似；（2）由于在非共价分子印迹过程中，功能单体和模板分子的结合处于动态平衡，可导致产生不同结合能力的结合位点。

3 结论

以丙烯酰胺-乙二醇二甲基丙烯酸酯为基体的印迹聚合物 P(3，4，5-THBA)对 3，4，5-THBA 具有选择性结合能力，氢键作用在其分子识别过程中起重要作用。Scatchard分析表明，P(3，4，5-THBA)对 3，4，5-THBA 存在两类不同结合能力的结合位点，高亲和力结合位点的离解常数KD1=2.4×10-4mol/L，最大结合位点数Qmax1=30.6μmol/g；低亲合力结合位点的离解常数 KD2=2.3×10-3mol/L，最大结合位点数Qmax2=91.1μmol/g，其结合位点的不均匀性，是造成其色谱峰拖尾的原因。