凝胶色谱法测定法罗培南钠颗粒高分子杂质的含量

杨 娜，巩丽萍，王维剑，丁 勃

(山东省食品药品检验所，山东济南250101)

法罗培南(fampenem)是1997年投放市场的第1个青霉烯类抗生素，对各种β－内酰胺酶稳定，对厌氧革兰阳性菌及多数革兰阴性菌的抗菌活性均等同于或优于头孢菌素及青霉素类抗生素［1］.目前，在各国药典中，仅《日本药典》中有收载，但未列高分子杂质检查项目.因法罗培南是一种临床上常用的β－内酰胺类抗生素.经多年研究证明，β－内酰胺类抗生素所致的速发型过敏反应并非药物本身所致，是和此类药物中存在的高分子杂质有关，故建立其法罗培南聚合物含量的测定方法，以更好地控制产品的质量.

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪:G1310A单元泵;G1314A检测器;CAG Bootp Server程序.

1.2 药品与试剂 法罗培南钠对照品(批号:090401，含量:81.1%，山东新时代药业有限公司);法罗培南钠颗粒 (批号090601，090602，090603，山东新时代药业有限公司，规格200 mg).葡聚糖凝胶G－10(进口)、蓝色葡聚糖2000、磷酸氢二钠(分析纯)、磷酸二氢钠(分析纯).

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:自制葡聚糖凝胶G－10(不锈钢内径为1.3 cm，柱高度为40 cm)色谱柱;流动相A为pH7.0的0.1 mol·L 磷酸盐缓冲液［0.1 mol·L 磷酸氢二钠 －0.1 mol·L磷酸二氢钠)(61∶39)］，流动相 B 为水;流速:1.0 mL·min－1;检测波长:254 nm，进样量 100 μL.取 0.1mg·ml－1蓝色葡聚糖2000溶液100 μL注入液相色谱仪，分别以流动相A、B为流动相测定，记录色谱图.理论板数按蓝色葡聚糖2000峰计算均应不低于700，拖尾因子均应小于2.0.在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值应在0.93～1.07之间.称取法罗培南钠对照品12.36 mg，置200 mL量瓶中，用0.1 mg·mL－1的蓝色葡聚糖2000溶液溶解并稀释至刻度，摇匀.量取100 μL注入液相色谱仪，以流动相A进行测定，记录色谱图.高聚体的峰高与单体与高聚体之间的谷高比应大于2.0.另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液100 μL，连续进样5次，峰面积值的相对标准偏差应不大于 5.0%［2］.

2.2 检测限与定量限的测定 取法罗培南钠对照品，用水制成每1 mL含法罗培南钠24.59 μg的溶液，以流动相A为流动相，精密量取100 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，此时峰高约为基线噪音的3倍(S/N约为3)，据此计算本品检测限为 2.46 μg，定量限为 8.2 μg.

2.3 专属性试验

2.3.1 葡聚糖2000溶液的制备 用水制成每1 mL含葡聚糖2000 0.1 mg的溶液.

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取法罗培南钠对照品13.54 mg，置200 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀.

2.3.3 供试品溶液的制备 取法罗培南钠颗粒(平均装量为 1.872 2 g，规格为 0.2 g)2.405 6 g，置 50 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀.

2.3.4 分离度溶液的配制 取法罗培南钠颗粒适量，用0.1 mg·L－1蓝色葡聚糖2000溶液溶解稀释制成每1 mL含法罗培南 512.55 μg，量取 100 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图见图1.蓝色葡聚糖2000与供试品主峰达到有效分离.保留时间表示流动相流速确定条件下的Kav=0的洗脱时间，即相当于被排阻的聚合物洗脱的保留时间，法罗培南钠聚合物的峰与蓝色葡聚糖的峰重叠，保留时间一致.

2.4 对照品溶液的线性和范围 精密称取法罗培南钠对照品10.06 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用.分别取 100、88、75、62.5、50、25、12.5 和 6.25 μL 进样，记录色谱峰(图2).

图1 法罗培南钠颗粒与葡聚糖2000色谱图

图2 法罗培南对照品色谱图

图3 法罗培南钠颗粒色谱图

表1 对照品溶液的线性试验测定结果

结论:法罗培南钠对照品溶液5.1 ～81.6 μg·mL－1浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系.

2.5 供试品浓度与聚合物峰面积的线性和范围 精密称取法罗培南钠颗粒2.580 4 g(相当于法罗培南0.275 7 g)，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用.分别取100、80、60、40、20 和 10 μL 进样，记录色谱峰(图 3).

表2 供试品溶液浓度与聚合物峰面积的线性试验测定结果

结论:供试品溶液在55.14 ～551.40 mg·mL－1范围内与法罗培南钠聚合物峰面积呈良好的线性关系.

2.6 F值的稳定性试验 照2.4配制法罗培南钠对照品溶液(50.931 μg·L－1)，在室温下放置，分别于0，2，4，6，8，24 h取样，按上述色谱条件进样测定，其法罗培南钠峰面积分别为:3 885.193、3 886.425、3 853.446、3 797.703、3 798.836、3 788.945，计算F值(法罗培南钠对照品浓度/与主峰面积比值).

表3 F值的重复性试验

2.7 法罗培南钠聚合物含量测定 取供试品照2.3.3配制供试品溶液;取2.4配制法罗培南钠对照品溶液(50.931 μg·L－1)，照2方法与结果的色谱条件进行测定，结果见表4.

表4 样品法罗培南钠聚合物的含量测定

3 讨论

3.1 本方法是利用凝胶色谱分子筛机制，让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻不能进入凝胶颗粒内部，在色谱过程不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为在Kav=0处流出.

实验表明，在特定条件下，β－内酰胺类抗生素可以缔合形式表现分子量较大的缔合物，缔合物在Sephadex G10凝胶色谱系统中的色谱行为和高分子杂质一样，都在Kav=0处，表现为单一的色谱峰.按色谱条件对相关保留时间进行比较，确定供试品色谱图中Kav=0处的峰即为聚合物峰.

3.2 采用自身对照外标法以法罗培南钠对照品为对照，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标，在改变色谱条件，测得供试品中的高分子杂质峰响应指标.方法简便、快速，且自身对照外标法无需专门制备标准品又可同外标法一样精确对高分子杂质峰进行定量，结果直观.

3.3 对一个厂家3批次的法罗培南钠颗粒分别进行高分子杂质测定，用自身对外标法进行定量.三批法罗培南钠颗粒含量在0.13% ～0.14%范围.

［1］赵霞，胡昌勤，金少鸿.法罗培南钠中有关物质测定方法的建立［J］.中国药学杂志，2005，40(5):68 －70.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社.2010.