PLACKETT-BURMAN设计和响应面法优化火红密孔菌发酵产漆酶培养基

张田田，沈明浩

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118)

PLACKETT-BURMAN设计和响应面法优化火红密孔菌发酵产漆酶培养基

张田田，沈明浩*

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118)

目的:借助MINITAB15.0，采用Plackett－Burman实验设计法及响应面分析法，对影响火红密孔菌发酵产漆酶的培养基成分进行优化研究。方法:首先利用Plackett－Burman实验设计筛选出影响产酶的三个主要因素，即麦麸、葡萄糖和蛋白胨。在此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域，再利用Box－Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析。结果:麦麸、葡萄糖和蛋白胨与漆酶活力存在显著的相关性，通过求解回归方程得到优化发酵条件:麦麸2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。此时，漆酶活力达到最大值330.66U/mL，与初始设计发酵培养基中(238U/mL)相比漆酶活力提高了38.9%。结论:首次利用数学统计方法优化了火红密孔菌发酵产漆酶培养基，并建立数学模型，为该菌株漆酶的工业应用提供了一定的理论依据。

漆酶，响应面法，Plackett－Burman，火红密孔菌

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(EC1.10.3.2)，广泛存在于真菌、植物、细菌中［1－3］，但其中最主要的生产者是担子菌中的白腐菌。漆酶与木素过氧化物酶、锰过氧化物酶同属于木质素降解酶类［4］。漆酶的作用底物非常广泛，能催化酚、芳胺、羧酸等6大类250多种物质发生羟基自由基介导的羟化、歧化、聚合等反应［5］;特别是能有效降解环境污染物如二恶英、多氯联苯、DDT等［6］。漆酶研究已有一百多年的历史，是人类研究最早的酶之一，因其较强的氧化还原能力，和其在环境保护、生物检测、造纸工业、食品工业等领域中的应用而受到人们的广泛关注。实验菌株火红密孔菌(Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr)来源于中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，是属于担子菌纲，多孔菌科的一种腐生真菌。已有文献报道，该菌株可合成具有抗菌活性的物质，且能生产多种具有工业价值的酶类［7］。漆酶是火红密孔菌分泌的多种胞外酶的一种，具有重要的工业应用价值，对偶氮、三苯甲烷和蒽醌素都有很好的降解作用［8］。目前，国内极少见火红密孔菌发酵产漆酶营养条件的研究报道，本实验在Plackett－Burman实验设计的基础上，对影响火红密孔菌产漆酶的麸皮、葡萄糖及蛋白胨三个主要因素进行Box－Behnken实验设计，并采用响应面分析法对三者之间的相互作用进行了回归分析，对漆酶的工业生产具有一定的参考价值。本实验的实验设计及结果分析是由软件MINITAB 15.0辅助完成的。

表1 N=12的Plackett－Burman的实验设计及响应值

表2 Plackett－Burman实验设计的因素水平及效应分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

火红密孔菌(Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr)

中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所;斜面种子培养基 马铃薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，VB10.001%，琼脂2%;液体种子培养基 马铃薯20%，葡萄糖2%，酵母浸粉1%;初始设计发酵培养基 同液体种子培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵培养 250m L三角瓶中装液体培养基100m L，接入 6～7日龄平板菌种 3～5片(8mm)，130 r/m in、32℃下恒温振荡培养。

1.2.2 粗酶液制备 取培养7～10d的发酵液，1000 r/m in离心10m in，上清即为粗酶液，冰箱保存备用。

1.2.3 酶活测定 参照吴涓［9］、王宜磊［10］的漆酶活力测定方法(略改):0.1mol/L pH4.6的醋酸缓冲液3.5m L，加入3.36mmo1/L的邻联甲苯胺0.5m L，再加入适当稀释的粗酶液0.1m L，25℃保温5min，722E型紫外可见分光光度计测595nm处光密度(OD值)，酶活力以样品与底物反应5min后光密度的改变值表示，以每分钟光密度增加0.001为一个酶活力单位(U/m L)。

2 结果与分析

2.1 Plackett－Burman设计筛选产酶重要影响因子

通过查阅大量文献，并在前期实验的基础上，本实验选取可能影响产酶的8个因素:葡萄糖(A)、淀粉(B)、麸皮(D)、酵母浸粉(E)、酒石酸铵(G)、蛋白胨(H)、MgSO4·7H2O(J)、KH2PO4(K)进行实验次数N=12的Plackett－Burman实验。8个因素分别对应于表中的8个列，每个因素取低水平“－1”和高水平“1”。另设3个虚拟列，考察实验误差。以漆酶活力为响应值，对实验结果进行分析，得出各因素的t值和可信度水平。一般选择可信度大于90%以上的因素作为重要因素。实验设计及结果见表1，各因素主效应分析见表2。

由表2的主效应分析结果可知，在PB设计的二水平范围内，影响火红密孔菌发酵产漆酶的重要因素为葡萄糖、麸皮和蛋白胨的浓度，其可信度均在90%以上。考虑到发酵培养基的碳源、氮源均已确定，而其他因素对漆酶活力的影响不显著，为避免实验资源的浪费，发酵培养基组成确定为麦麸、葡萄糖和蛋白胨。故在下一步响应面分析中只考察麦麸、葡萄糖和蛋白胨浓度的最优水平。

表5 回归模型方差分析

2.2 最陡爬坡实验设计及结果

响应面拟合方程只有在考察的临近区域内才能充分近似真实情形，所以要先逼近最佳区域后才能建立有效的响应面拟合方程［11］。因此根据Plackett－Burman实验筛选出的显著因子，设计它们的变化方向及步长进行最陡爬坡实验是很有必要的，实验设计及结果见表3。由表3可知，最优发酵条件可能在实验3附近，故以实验3的条件为响应面实验的中心点。

表3 最陡爬坡实验设计及结果

2.3 响应面设计确定显著因子的最佳值

由最陡爬坡确定的实验因素中心点，根据Box－Behnken的中心组合设计原理，设计了三因素三水平运行次数为15次的响应面分析实验。麦麸浓度x1(%)，葡萄糖浓度x2(%)和蛋白胨浓度x3(%)自变量经过下述公式分别进行编码转换:A=x1－2.5;B=x2－2;C=(x3－1.2)/0.2。实验设计及结果见表 4。9.00B－7.00C－25.17A2－64.17B2－61.17C2+22.00AC+6.00BC。其中Y为预计响应值，A、B、C为变量的编码值。

表4 响应面Box－Behnken设计矩阵和实验结果

对结果进行方差分析(表5)可知，方程的显著统计程度较高，失拟项为0.335≫0.05，模型决定系数R2=99.32%，表明回归方程有较好的拟合度，因此可用该回归方程代替实验真实点对火红密孔菌发酵产漆酶进行分析和预测。

对回归方程求一阶偏导数可得模型的极值点，分别为:A=0.0230，麦麸浓度为2.523%，B=0.0678，葡萄糖浓度为2.068%，C=－0.0497，蛋白胨浓度为1.190%。其相对应的响应值为347.84U/m L。考虑到实际操作的可行性，将火红密孔菌发酵培养基的成分在理论值基础上修正为:麦麸2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。在上述条件下对模型预测值进行实验验证，漆酶活力为330.66U/m L，实验值与理论值误差在5%之内，属正常范围，可见模型可以较好地预测实际发酵情况。

根据回归方程利用MINITAB 15.0绘出响应面图，即图1～图3。每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用，此时第三个变量保持在最佳水平。由图1显示，蛋白胨含量为1.2%时，葡萄糖与麸皮含量对火红密孔菌发酵产漆酶活力的影响。由图1可知，葡萄糖对漆酶活力的影响极其显著，表现为较陡的曲面;麦麸含量对漆酶活力影响较小，曲面较平滑。图2显示，葡萄糖含量为2.0%时，麸皮与蛋白胨含量对漆酶活力的影响。由图2可知，蛋白胨含量对漆酶活力的影响较为显著，曲面变化幅度大;当蛋白胨含量较低，而麦麸含量较高时，显著降低了漆酶的活力，不利于火红密孔菌漆酶的分泌。图3显示了葡萄糖与蛋白胨交互作用对漆酶活力的影响。从图3可以看出，葡萄糖和蛋白胨含量取某适中值时会使漆酶活力达到最大值，且过高或过低都会使漆酶活力降低。

利用统计软件MINITAB 15.0对实验数据进行二次多项回归拟合，回归模型为:Y=347.33+2.50A+

图1 漆酶活力与葡萄糖，麦麸的响应曲面图

图2 漆酶活力与蛋白胨，麦麸的响应曲面图

图3 漆酶活力与蛋白胨，葡萄糖的响应曲面图

3 结论

火红密孔菌是一种较为常见的腐生真菌，可导致木材的白色腐朽，广泛存在于我国东北林区。火红密孔菌在固体和液体发酵基质中均可发酵生产漆酶。已有文献报道，在诱导条件下火红密孔菌可产生多种亚型的漆酶，且在最优诱导条件下漆酶活力为1368U/L［12］。本文通过大量预实验，选取对漆酶活力有影响且较为常见的碳源和氮源对火红密孔菌发酵产漆酶培养基进行优化。Plackett－Burman实验结果显示，相对其他碳源而言，葡萄糖对漆酶活力影响较为显著，而氮源中蛋白胨的影响较为显著，这与方华等［13］的研究报道相一致。响应面的结果显示，葡萄糖浓度、蛋白胨浓度及麦麸浓度与漆酶活力存在显著线性关系，其中葡萄糖浓度与麦麸浓度呈正相关，蛋白胨浓度呈负相关，表明高碳低氮有利于火红密孔菌漆酶的分泌，而麦麸浸出液中丰富的营养成分也为漆酶的分泌提供了有利条件。图1～图3显示，麦麸、葡萄糖和蛋白胨三者浓度均存在最佳值，在小于或大于最佳值时漆酶活力均有所下降。可能原因是当浓度小于最佳值时，营养成分供给不足，菌体生长缓慢;而当浓度大于最佳值时，菌体大量生长，两者菌体密度均不适合发酵产酶，因此酶活力下降。

发酵培养基的优化是多因素多水平实验设计，单因素实验和正交实验工作量大且难以得到较快较好的结果。本文将Plackett－Burman设计与响应面分析法相结合，可以快速、有效地从影响火红密孔菌发酵产漆酶的因素中筛选出主要影响因素，避免了非主要因素可能造成的时间和资源的浪费，并且可实现条件优化，优化的预测结果与实验结果吻合性也较好。

经过优化，确定了火红密孔菌的最佳产酶培养基为:麦麸2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。此时火红密孔菌经发酵所产漆酶的活力为330.66U/m L，与初始设计发酵培养基(238U/m L)相比漆酶活力提高了38.9%。本实验仅从培养基成分方面对火红密孔菌产漆酶条件进行了优化，不够全面，培养条件和诱导剂等方面的相关研究将会陆续进行。

［1］Alexandre G，Zhulin IB.Laccases are widespread in bacteria［J］.Trends in Biotechnology，2000，18(2):41－42.

［2］兰瑞芳，林少琴，林玉满，等.杏鲍菇漆酶的生物学特性［J］.食用菌学报，2002，9(2):14－16.

［3］Wan Yun－Yang，Du Yu－Min，Yang Fang－Xing，et al.Purification and characterization of hydrosoluble components from the sap of Chinese lacquer tree Rhus vernicifera［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2006，38(3－5):232－240.

［4］池玉杰，伊洪伟.木材白腐菌分解木质素的酶系统－锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶催化分解木质素的机制［J］.菌物学报，2007，26(1):153－160.

［5］季立才，胡培植.漆酶催化氧化反应研究进展［J］.林产化学与工业，1997，17(1):79－84.

［6］林鹿，庞春生，黄伟韩，等.自然水体介质中白腐菌对二噁英类物质的降解［J］.环境化学，2005，24(5):595－598.

［7］Lu Lei，Zhao Min，Zhang Bei－Bei，et al.Purification and characterization of laccase from Pycnoporus sanguineus and decolorization of an anthraquinone dye by the enzyme ［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74:1232－1239.

［8］Pointing SB，Vrijmoed LLP.Decolorization of azo and triphenyl methane dyes by Pycnoporus sanguineus producing laccase as the sole phenoloxidase［J］.World Journal of Microbiol＆ Biotechnol，2000，16:317－318.

［9］吴涓，肖亚中，王怡平，等.蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定［J］.厦门大学学报，2001，40(4):893－898.

［10］王宜磊，邓振旭，朱陶，等.彩绒革盖菌CV－8漆酶活性的初步研究［J］.微生物学杂志，1998，18(4):60－62.

［11］Li C，Bai JH，Cai ZL.Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using response surface methodology［J］.Journal of Biotechnology，2002，93:27－34.

［12］Pointing SB，Jones EBG，Vrijmoed LLP.Optimization of laccase production by Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture［J］.Mycological Society of America，2000，92:139－144.

［13］方华，黄俊，陈瞾，等.白腐菌分泌漆酶的培养条件研究［J］.化学与生物工程，2008，25(8):30－33.

Optimization of culture medium for laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr by Plackett－Burman design and response surface methodology

ZHANG Tian－tian，SHEN ming－hao*

(College of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，China)

Objective:Drawing assistance from mINITAB 15.0 software，Plackett－Burman experimental design and response surface methodology were applied to optimizing culture medium for laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr.Method:The important factors influencing laccase production，which identified by initial experimental design of Plackett－Burman were wheat bran，glucose and pep tone.The path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the three significant factors.Box－Behnken design and response surface analysis were adopted to further investigate the mutual interaction between the variables and obtain optimal values that bring maximum laccase activity.Results:The results showed that wheat bran，glucose and pep tone all had significant influence on the activity of laccase.The optimal conditions for the maximal activity discriminated from the reg ressionequation were:wheat bran 2.5%，glucose 2.0%，pep tone 1.2%，natural pH.The maximum value was 330.66U/m L.Compared with the laccase activity(238U/m L)cultured in fermentation medium it increased 38.9% under the optimal conditions.Conclusion:Culture medium for Laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr was optimized for the first time using statistics and the mathematical model for laccase production was established.

laccase;response surface methodology;Plackett－Burman;Pycnoporus Sanguineus(Fr.)

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0223－04

2010－09－01 *通讯联系人

张田田(1986－)，女，在读硕士，研究方向:发酵工程，食品安全。

吉林省科技厅课题(20090553)。