15味中草药对5种临床分离菌株的体外抑菌效果观察

李成叶，王德海*

（华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070）

随着养殖业的发展，动物疫病的发生与流行越来越复杂，并具有混合感染和继发感染的新特点，在疾病的治疗方面，抗生素以其方便、高效的优势在临床应用中占据主导地位，但由于抗生素类药物的广泛使用，使得病原菌的抗药性日趋增强，而由于抗生素滥用而导致的抗生素残留问题也引用了全社会的关注[1]。本试验采用的5种细菌中，金黄色葡萄球菌是对人类危险性最大的化脓性球菌[2],在医院检测的所有样本中检出率达到55.1%，是医院内交叉感染的重要传染源[3],近年来由于广泛应用抗生素，耐药菌株迅速增多，对青霉素-G、红霉素、氨芐西林、复方新诺明、苯唑西林等常用抗菌药物耐药率均达60%以上[4]；链球菌血清型较多，也已出现了较多种的耐药菌株；而大肠杆菌又属于多血清型和变异性强的细菌，极易产生抗药性[5]。因此，既能有效控制疾病的发生，又能降低细菌的耐药性，进而降低抗生素的滥用就成为当前药物研究的一个方向。

中草药作为一种无污染、绿色、天然的药物，具有多能性、性质稳定、资源广泛、价格低廉的特点，且不易产生耐药性，毒副作用小，已经证实多种中草药有抑菌或抗菌作用[6],其作为替代抗生素解决抗药性和药物残留等方面的优势越来越受到重视。利用中草药防治动物疾病，既是饲养动物的需要，也是人们生活保健的需求。

本实验以栀子、艾叶、百部、黄连、贯众、鱼腥草、夏枯草、蒲公英、大青叶、黄柏、黄芩、紫草、金银花、败酱草、连翘15味中草药对临床分离的5株细菌（金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、链球菌、鸡大肠杆菌、仔猪大肠杆菌）的体外抑菌效果进行观察，从而为临床应用和科学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

金黄色葡萄球菌菌株分离自患葡萄球菌性关节炎鸡的关节部位；白葡萄球菌分离自患葡萄球菌病鸭的肝脏部位；鸡大肠杆菌分离自患大肠杆菌病鸡的肝脏部位；链球菌分离自患链球菌性关节炎猪的关节部位；仔猪大肠杆菌分离自患大肠杆菌病仔猪的十二指肠部位。

以上菌株由华中农业大学动物医学院病理教研室分离、鉴定、保存，临用前分别供试菌株在基础培养基上培养18h，用生理盐水将菌苔洗下，稀释至浓度为1.2×1010CFU/ml的菌悬液，备用。

1.2 试剂及药品

1.2.1 供试中草药

栀子、艾叶、百部、黄连、贯众、鱼腥草、夏枯草、蒲公英、大青叶、黄柏、黄芩、紫草、金银花、败酱草、连翘均购于武汉市天然药物医疗研究院。

临用前将各种中草药分别称取10g，放入三角烧瓶中，加入100ml以上自来水使淹没过药面5cm左右，浸泡30min后加热煮沸30min，滤纸过滤取药液，药渣按以上方法再次操作，合并两次药液，加热煮沸浓缩至10ml。即得每毫升含1g生药的药液。经115℃高压灭菌30分钟并补充水分后备用.

（1984年1月6日讲座，全文略有删节。吴培华教授提供讲座录音，史悠整理，刘祥安教授审阅，在此特申谢忱！）

1.2.2 基础培养基

将15ml、pH7.4的灭菌基础培养基倾注于培养皿中，37℃培养24h，观察无菌生长后，4℃冰箱保存备用。

1.3 试验设计

按美国临床实验室标准委员会（NCCLS）的要求进行试验设计，并进行适当改进。吸取20μl制备的菌悬液加入制备的基础培养基表面，均匀涂布，于室温下干燥3～5min后，用外径6mm的硬塑料管将涂布有菌悬液的基础培养平板等间隔对称地打4个孔，挑出孔中培养基，并在酒精灯火焰上对培养平板封底，将各种供试中草药用蒸馏水稀释成 1.00g/ml、0.75g/ml、0.50g/ml、0.25g/ml、0.10g/ml、0.05g/ml等 6 个浓度，吸取药液50μl加入孔中，每种中草药每个浓度设4个重复，然后将培养平板放入37℃温箱培养18h用游标卡测量抑菌圈直径，同种中草药同一浓度取其抑菌圈直径的平均值，此即各种中草药在不同浓度下对供试菌株的抑菌效果。

1.4 抑菌效果判断标准

参考NCCLS推荐的标准进行判断，以抑菌圈直径＞20mm为极敏，抑菌圈直径在15～20mm之间为高敏，抑菌圈直径在10～15mm之间为中敏，抑菌圈直径＜10mm为低敏，无抑菌圈为耐药。

2 结果与分析

2.1 供试中草药对临床分离金葡菌的抑菌效果

表1 15种中草药在不同浓度下对鸡关节源性金葡菌的体外抑菌效果（n=4,单位mm）

表2 15种中草药在不同浓度下对鸭肝脏源性白葡菌的体外抑菌效果（n=4,单位mm）

表3 15种中草药在不同浓度下对猪关节源性链球菌体外抑菌效果（n=4，单位mm）

表4 15种中草药不同浓度下对鸡肝脏源性大肠杆菌的体外抑菌效果（n=4,单位mm）

由表2可知，对供试菌株白葡萄球菌来说，在1.00g/ml浓度时除栀子外其它中草药都表现为极敏。其中对0.10g/ml浓度以上的黄芩和金银花，0.50g/ml浓度以上的艾叶、百部、贯众、大青叶、紫草和败酱草，0.75g/ml浓度的黄连、夏枯草和连翘也表现为极敏。而对0.05g/ml浓度以上的贯众、大青叶、紫草、黄芩和金银花，0.10g/ml浓度以上的百部、鱼腥草、夏枯草和败酱草，0.25g/ml浓度以上的艾叶、黄连和连翘，蒲公英和黄柏分别在0.5g/ml、0.75g/ml浓度以上时都表现为高敏。对1.00g/ml的栀子表现为中敏，同样表现为中敏的还有0.05g/ml时的百部、鱼腥草、夏枯草、败酱草和连翘，0.10g/ml浓度时的黄连、蒲公英和连翘，0.25g/ml浓度的蒲公英和黄柏以及0.50g/ml浓度的黄柏。供试菌株对0.75g/ml和0.5g/ml浓度的栀子，0.1g/ml浓度的艾叶，0.05g/ml浓度的黄连和蒲公英均表现为低敏。而白葡萄球菌对0.25g/ml浓度以下的栀子，0.01g/ml浓度的黄柏，以及0.05g/ml浓度的艾叶均表现为耐药。

由表3可知：供试菌株对1.00g/ml浓度的鱼腥草、大青草、黄柏、紫草和连翘，以及0.50g/ml浓度以上的百部和金银花均表现为极敏。而对1.00g/ml浓度的艾叶、贯众、蒲公英、黄芩和败酱草，0.75g/ml浓度的黄柏，0.50g/ml浓度以上的大青叶，0.25g/ml浓度以上的百部、紫草和连翘，以及0.10g/ml浓度以上的鱼腥草和金银花均表现为高敏。供试菌株表现为中敏的药物有0.75g/ml浓度以上的栀子和艾叶，0.50g/ml浓度以上的黄连、蒲公英和败酱草，0.25g/ml浓度的大青叶和黄柏，0.05g/ml浓度以上的贯众、鱼腥草、紫草、金银花和连翘。而对0.50g/ml浓度的栀子和艾叶，0.25g/ml浓度以上蒲公英和败酱草，0.10g/ml浓度的百部和大青叶，0.05g/ml浓度的大青叶均表现为低敏。而链球菌表现为耐药的中草药有夏枯草，0.75g/ml浓度以下的黄芩，0.25g/ml浓度以下的栀子、艾叶和黄连，0.10g/ml浓度以下的蒲公英、黄柏和败酱草。

由表4可知：供试菌株只对1.00g/ml浓度时的败酱草和连翘，0.75g/ml浓度以上的大青叶和黄芩表现为极敏。而对1.00g/ml浓度时的栀子、艾叶、百部、蒲公英和黄柏，0.50g/ml浓度以上的大青叶和紫草，0.25g/ml浓度以上的连翘，0.10g/ml浓度时的黄芩表现为高敏。而对1.00g/ml浓度时夏枯草，0.75g/ml浓度以上的栀子、百部和黄连，0.5g/ml浓度的艾叶，0.25g/ml浓度的大青叶，0.1g/ml浓度以上的蒲公英、紫草和败酱草，以及0.05g/ml浓度以上的黄芩和连翘，均表现为中敏。而对0.25g/ml浓度时艾叶，0.10g/ml浓度的大青叶和0.05g/ml浓度的蒲公英、紫草和败酱草均表现为低敏。而供试菌株对贯众、鱼腥草和金银花表现为完全耐药，其次对0.75g/ml浓度以下的夏枯草，0.5g/ml浓度以下的栀子、百部、黄连和黄柏，以及0.10g/ml浓度以下的艾叶和0.05g/ml浓度的大青叶也表现为耐药。

表5 15种中草药在不同浓度下对仔猪十二指肠源性大肠杆菌的体外抑菌效果（n=4,单位mm）

表5可知：供试菌株只对1.00g/ml浓度时的大青叶、连翘、金银花以及0.50g/ml浓度以上的败酱草表现为极敏。对1.00g/ml浓度时的艾叶和蒲公英，对0.75g/ml浓度以上的栀子、大青叶和紫草，0.5g/ml浓度以上的金银花、黄芩，以及0.25g/ml浓度的败酱草，0.10g/ml浓度以上的连翘均表现为高敏。供试菌株表现为中敏的药物有1.00g/ml浓度的贯众和黄柏，0.75g/ml浓度以上的百部、黄连和夏枯草，0.5g/ml浓度的栀子和大青叶，0.25g/ml浓度以上的蒲公英，0.1g/ml浓度以上的黄芩，和0.05g/ml浓度以上的紫草、连翘、败酱草和金银花。表现为低敏的药物有0.75g/ml浓度的艾叶，0.5g/ml浓度的黄连，0.25g/ml浓度的大青叶和0.10g/ml浓度以下的蒲公英。而供试菌株表现为耐药的中草药有鱼腥草，0.75g/ml浓度以下的贯众和黄柏，0.5g/ml浓度以下的艾叶、夏枯草和百部，0.25g/ml浓度以下的栀子和黄连，0.10g/ml浓度以下的大青叶和0.05g/ml浓度的黄芩。

3 讨论与结论

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素链球菌（PRP）目前已成为一些大型综合医院常见的院内感染菌，常表现为多重耐药性[7]；而大肠杆菌是医学和兽医临床常见的病原菌之一，由于该菌一直依靠抗生素进行控制，使得耐药性也越来越严重。由于耐药菌株感染而造成疾病蔓延使得畜禽养殖业损失惨重，同时抗生素的残留也越来越重，药物的使用寿命越来越短，防治越来越困难。为了保证食品安全和生产效益不受影响，提高在高密度下饲养畜禽的抗病力就成为当前畜牧工作者的一个重要课题。不用抗生素提高畜禽的抗病力不仅有利于动物健康、动物福利和生产效率，而且还可以提高畜禽生产中的微生物安全。

本试验所选用的15味中草药为临床用于疾病防治的常用药物，经过实验室前期验证，在疾病的防治方面有确定的疗效，如用于奶牛乳房炎、仔猪腹泻以及鸡葡萄球菌病等的防治方面，都显示了明显的优势。由于中草药的天然性和多能性的特点，在临床应用中一方面对相关疾病具有防治作用，同时调控机体的平衡，起到调节脏腑和阴阳平衡的作用，有助于提高畜禽自身的免疫力和生产力，因此利用中草药防治动物疾病，已成为当前畜牧兽医界一个热点课题。

本试验的结果显示：不同种类中草药对不同菌株的抗菌效果不同，并且对G+菌株和G-菌株的抑菌效果有明显的差异，百部、金银花、鱼腥草、连翘、黄柏、紫草、大青草等7种中草药对G+菌株抑菌效果明显，败酱草、大青叶、金银花和连翘则对大肠杆菌具有明显的体外抑菌效果。这可能与药物本身所含成分有关外，药物的作用机制（如影响细菌细胞壁或抑制细菌内某些酶如DNA聚合酶、RNA聚合酶等的活性）应该发挥了重要的作用，但这有待于进一步探讨。而在这15种中草药之中，对大肠杆菌的抑菌效果较差的贯众和鱼腥草，对G+则具有明显的抑菌效果，出现这种结果的原因可能与细菌自身所含的脂多糖、磷脂、蛋白质和脂蛋白复合物组成的三层外胞壁结构有关，因此在中草药饲料添加剂的配伍方面，除了分离菌株进行生化分析外，还应该进行药物敏感性的试验研究。

参考文章：

[1] 陈泳，李洪，张丽华，等.3594株病原菌的分布及耐药性研究[J].中国医院用药评价与分析，2011,11（4）：350-352

[2] 姚冰，彭晓燕，李晓波.2010年抗菌药物应用与细菌耐药性分析[J]。中国医院用药评价与分析，2011,11（4）：353-356

[3] 许亚茹，郑秀芬，元小冬，等.神经内科医院感染患者的病原菌谱及耐药性研究[J].2010,20（3）：427～429

[4] 佟爱华，董梅，匡铁吉.葡萄球菌医院感染临床分布于耐药率动态变迁特征分析[J].现代生物医学进展，2009,9（22）：4314～4317

[5] 罗玲、杨峻，艾地云，等.湖北省部分肉鸡场致病性大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析[J]。动物医学进展，2011,32（3）：128-131

[6] 李成叶，袁硕峰，林奕，等.32味祛风湿中药对2个分离菌株的体外抑菌作用[J].动物医学进展，2010,31（11）：43-46

[7] 周军，温绍霞.重症监护病房与普通病房静脉导管感染原病菌分布调查[J].山西医药杂志：2011,40（4）：355-356