痰热互结和热盛伤津型2型糖尿病患者单个核细胞基因表达谱差异研究

吕俊海，李 敏，刘 红，仝小林，于友华，孙明杰△

(1.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;2.中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

本研究以痰(湿)热互结和热盛伤津型2型糖尿病患者为研究对象，采用基因芯片技术，考察两种证型2型糖尿病患者与正常对照组以及两种证型之间的外周血单个核细胞的基因表达谱特征，为从中发现和阐明在相应证型Ⅱ型糖尿病的发病及进展中起关键作用的基因及信号通路打下基础，并为中医诊断和治疗该疾病提供精确的现代科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

20名受试者被纳入本研究。10名为2型糖尿病痰热互结型 (A组)，平均年龄为41.7岁;4名为 Ⅱ型糖尿病热盛伤津型(B组)，平均年龄为44.5岁;6名为年龄和性别匹配的正常对照(C组)，平均年龄为38.3岁。2型糖尿病西医诊断符合1999年WHO诊断标准。各证型的中医诊断标准依据国家《糖尿病中医防治指南》及 SFDA《中药新药临床研究指导原则》证型诊断标准。

1.2 样品制备

抽取每名受试者8ml全血置于含0.1ml 1%肝素抗凝管中，采用 Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，用 TRIzol(Invitrogen)试剂抽提 PBMC RNA并用 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)纯化，采用分光光度计 (Nanodrop ND-1000)和1%琼脂糖凝胶电泳评价 RNA的质量和完整性。随后采用基于 T7扩增方法取1μg RNA进行线性扩增，其余存放于－80℃冰箱中以备后续实验。反转录过程中进一步用 Cy3(Ambion Amino Allyl MessageAMPⅡaRNA labeling kit)标记 aRNA。

1.3 芯片杂交

标记后的 aRNA纯化后与芯片(Human OneArrayTMmicroarray)杂交，42℃杂交箱中避光杂交18h后用 1×SSC/0.2%SDS洗涤 10min，0.1×SSC/0.2%SDS洗涤 10min，重复2次，0.1×SSC洗片5min，重复2次。每样品做2个杂交重复。

1.4 扫描和分析

最后在Axon GenePix 4000B扫描仪获取图像，使用GenePix pro V6.0软读取图像初始信号值。信号值和信噪比(SNR)均大于0的基因进入下一步分析。用 Expander软件进行标准化(Quantile Normalization)处理后，采用倍数变化(≥1.5)，和 t检验方法(P≤0.05)筛选两组样本间的差异表达基因。

2 结果

2.1 RNA提取质量

所提取的20例全血样品PBMC的RNA的A260/A280均位于1.97和2.02之间，A260/A230均大于 1.95，说明 RNA的纯度很高。RNA电泳28S与18S条带清晰，亮度较高(见图 1)，证实所有标本的RNA满足芯片实验要求。

2.2 基因芯片结果

2.2.1 图2为3组样本PBMC基因表达谱的散点图，图中的点绝大部分集中在比值为 1的斜线周围，各组间信号强度R值接近于1，说明各组芯片杂交的信号强度一致性很好。

2.2.2 差异表达基因

图1 RNA琼脂糖凝胶电泳

图2 杂交信号强度组间比较散点图X轴和Y轴均为信号强度的log2值

根据筛选标准(表达差异倍数大于1.5，P值小于0.05)，将这3组样本表达谱分别进行比较。A组与C组相比，共有72条差异基因，其中7条为上调，65条为下调;B组与 C组相比，共有23条差异基因，其中13条为上调，10条为下调;A组与 B组相比，共有85条差异基因，其中22条为上调，63条为下调。表1～3列出部分各组间差异基因、编码蛋白或功能以及其在染色体上定位。从所得数据中还可看出基因ART1在B组中表达较A组和C组都高;基因KIAA1984和TRA2A在A组和B组中表达均低于 C 组;基因 CTSL、CYLD、IGSF4C、MDS009、PTPN2、RBM13和STK16在A组中表达较B组和C组均为低;基因C9orf127在 A组表达高于 C组，而在B组表达低于C组。

表1 A组与C组比较部分表达差异基因

表2 B组与C组比较部分表达差异基因

表3 A组与B组比较部分表达差异基因

3 讨论

2型糖尿病在中医学该病属于消渴病范畴，其早中期中医证候以痰(湿)热互结、热盛伤津、气阴两虚为主［4、5］。现代医学研究表明，多个基因变异与环境因素的影响共同决定该病的易感性。我们以西医糖尿病为基础，利用芯片技术，考察痰(湿)热互结、热盛伤津型病人在表达谱上的特征，为其证候生物学基础进行有益的探索，同时对确认中药的作用靶点及阐明糖尿病发病机理提供理论依据。

研究结果显示，2种不同证型的2型糖尿病组分别与正常对照组相比较，所得差异表达基因种类和数目大为不同，同时两类患者的基因表达也有明显差异，说明痰(湿)热互结和热盛伤津型2型糖尿病在基因表达水平上有着质的区别，提示中医证候的区分应有其分子水平物质基础。同时通过对差异表达基因编码产物的生物学功能及相关信号通路的进一步研究，可为阐明中药的作用位点和指导对相应中药的筛选及评价提供现代分子生物学依据。

基因TRA2A和BLVRA在A组和B组中表达均低于C组。TRA2A的编码蛋白调控着转录后RNA的编辑，使之释出不同蛋白变体，它的表达量下降有可能使得某些基因产物的缺乏，从而促进了糖尿病的发生和病理发展过程。BLVRA、胆绿素还原酶A是将胆红素转化为胆绿素的重要酶。胆绿素被证实是很重要的生理性氧自由基清除剂，被认为是最佳的抗自由基物质［3］。慢性高血糖状态以及游离脂肪酸(FFA)增高均可造成氧化应激的增强，使单核细胞产生的 ROS增多，促炎症转录因子NFκB活性增强，从而产生一系列促炎症反应，这对于糖尿病的继发损伤和并发症的产生与发展起重要作用。

基因CTSL、组织蛋白酶L参与许多特殊的生理过程，如激素原的激活、抗原呈递等。但在病理状态下，各种原因所致的细胞损伤导致溶酶体膜稳定性降低，通透性增高甚至破裂，大量CL释放到胞质或组织间隙并被激活，可降解细胞成分或细胞间质基质成分，包括层黏素、IV型胶原纤维及纤维连接素等，与人类许多疾病有关［4］。基因 CYLD编码一种蛋白酶，具有内源性泛素酶活性，其在调节 NF-kappa-B活化相关通路中起重要作用，如影响细胞生长、微管蛋白稳定性、自身免疫等等;这种蛋白发挥正常功能需要正常的细胞因子环境支持［5］。

在A组中，与免疫有关的基因，如 IL-15和IGSF4C表达量低于另2组，提示A组患者的免疫功能低下更为明显。加之与B组相比，A组下调基因数量远多于B组，也就是说该组患者细胞功能下降更明显。

综上所述，痰(湿)热互结、热盛伤津型2型糖尿病患者外周血单个核细胞表达谱较正常对照人群各有其特征性改变;这2种证型患者基因表达差异也很明显，涉及细胞代谢与信号转导、细胞凋亡、离子通道与运输蛋白、转录和转录因子等多条通路基因。

［1］ 赵天豫，段军，仝小林.中医治疗糖尿病的新思路［J］.光明中医，2002，17(5).

［2］ 牟新，周旦阳，赵进喜.糖尿病肾病中医证候量表的研制方法探讨［J］.中华中医药杂志(原中国医药学报)，2007，22(11).

［3］ 邢邯英，黄黛，野战鹰，凌亦凌，赵晓云.不同HO-1表达水平对糖尿病模型大鼠血管舒张功能及NOS的影响［J］.中国老年学杂志，2009，29(23).

［4］ 贺茂林，陈安民.反义表达人组织蛋白酶 L对骨肉瘤细胞侵袭特性的影响［J］.中国矫形外科杂志，2005，13(1).

［5］ Wei Jin， Mikyoung Chang， Emmanuel M. Paul，et al.Deubiquitinating enzyme CYLD negatively regulates RANK signaling and osteoclastogenesis in mice.J Clin Invest，2008，118(5):1858.