子宫内膜癌中PTEN与P27kipl蛋白表达及相关性研究

马学功，朱丛中，岳天孚

（天津医科大学总医院妇产科，天津300052）

子宫内膜癌是常见的女性生殖道三大恶性肿瘤之一，其中子宫内膜样腺癌（EECA）占80%~90%。张力蛋白同源第10号染色体丢失的磷酸酶基因（PTEN）是一种具有双重磷酸酶活性的抑癌基因，在子宫内膜癌尤其EECA中突变率最高，且与子宫内膜癌前病变—子宫内膜不典型增生（CAH）的发生有关，促进了CAH向子宫内膜癌的转化，PTEN基因表达减少或缺失有望成为早期子宫内膜癌及癌前病变的诊断指标之一[1]。P27kipl是近年发现的一种周期素依赖激酶抑制剂，可能是PTEN通过PI3K/AKT途径调节细胞分化增殖，诱导G1期阻滞过程的下游靶基因。本研究应用免疫组织化学方法检测PTEN及P27蛋白在子宫内膜癌病变中的表达，从而进一步探讨二者在EECA的早期诊断和预后判断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集天津医科大学总医院妇产科2000~2004年收治患者行诊断性刮宫及手术切除组织石蜡包埋标本，共90例，包括：正常增殖期子宫内膜组织标本20例；子宫内膜增生症组织标本18例，其中单纯或复杂增生8例，不典型增生10例；子宫内膜癌组织标本52例，其中EECA 45例，透明细胞癌4例，浆液性乳头状腺癌（UPSC）2例，黏液癌1例。EECA患者平均年龄57岁，术前未行放化疗，按组织学分级高分化（G1级）30例，中低分化（G2、G3级）15例；按FIGO手术-病理分期Ⅰ~Ⅱ期33例，Ⅲ~Ⅳ期12例。所有组织标本均由病理医生阅片复核，临床病理资料完整。

1.2 试剂 兔抗人PTEN多克隆抗体与鼠抗人P27单克隆抗体为北京中山生物制剂公司提供的美国Zymed公司产品(工作浓度均为1∶100)；免疫组化超敏SP试剂盒、DAB显色试剂盒等均为北京中山公司产品。

1.3 方法 蜡块组织连续切片，厚5μm，除做HE染色外，其余均按照试剂盒要求做免疫组化SP法染色。每批染色均设阴性和阳性对照。

1.4 结果判定 P27蛋白主要表达于细胞核内，为棕黄色颗粒；PTEN主要表达于胞浆，亦呈黄色或棕黄色颗粒。采取两人双盲法观察切片，随机选择10个高倍视野，计数1 000个实质细胞中阳性细胞的百分比，无阳性细胞为0分；阳性细胞比例小于10%为1分;10%～50%为2分；51%～80%为3分；大于80%为4分。按染色强度评分:不着色为0分；黄色1分；棕黄色2分；黄褐色3分。两者评分相乘，0分为阴性；1~3分弱阳性；4~6分为中度阳性；7~12分为强阳性[2]。

1.5 统计学分析 应用SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计处理，计数资料的统计学差异显著性比较用χ2或Fisher’s精确概率分析，两者相关性检验用Kendall’s等级相关分析。

2 结果

2.1 PTEN与P27在Ⅰ型、Ⅱ型子宫内膜癌中的表达 在Ⅰ型子宫内膜癌组织中PTEN与P27分别有57.8%和62.2%表达缺失,而在7例Ⅱ型子宫内膜癌组织中有6例PTEN与P27表达阳性，PTEN与P27在Ⅰ型子宫内膜癌中表达阳性率明显低于Ⅱ型（P<0.05），见表 1。

表1 Ⅰ、Ⅱ型子宫内膜癌中PTEN与P27蛋白的表达Tab 1 Expression of PTEN and P27 protein inⅠ、Ⅱtype EC

2.2 PTEN与P27在子宫内膜不同病变中的表达 正常内膜组PTEN蛋白的表达明显高于EECA组（P<0.01），与增生症组相比也有显著差异（P<0.01）；P27蛋白在正常内膜组中的表达明显高于 EECA 组（P<0.01），见表 2。

表2 PTEN与P27在子宫内膜不同病变中的表达Tab 2 Expression of PTEN and P27 protein in differenthistological group

2.3 EECA中PTEN与P27蛋白表达与临床病理指标的关系 PTEN蛋白在不同分化程度的组织中表达有显著性差异（P<0.05），而与年龄、手术病理分期、肌层浸润和淋巴结转移均无明显相关性。P27蛋白在不同年龄组的表达之间有显著性差异（P<0.01）；在不同手术病理分期中，Ⅰ~Ⅱ期的表达阳性率明显高于Ⅲ~Ⅳ期,两者之间存在显著差异（P<0.05）。P27的表达与组织学分级,肌层浸润和淋巴结转移均无明显相关，见表3。

表3 EECA中PTEN和P27表达与临床病理指标的关系Tab 3 The correlation of PTEN,P27 exp ression and clinicopathological features

2.4 P27与PTEN在EECA中表达的相互关系 由表4可以看出，在EECA中P27与PTEN的表达呈显著正相关。

表4 EECA中P27与PTEN表达的关系Tab 4 The correlation of PTEN and P27 immunostaining in EECA

3 讨论

子宫内膜癌的发病率逐年升高，依临床病理特征将其分为雌激素依赖型（Ⅰ型），即EECA和非雌激素依赖型（Ⅱ型）。PTEN基因是Ⅰ型子宫内膜癌中突变率最高的基因，定位于10q23染色体,具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性[3]。PTEN通过磷酸酶的活性使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化，负性调节PI3K/Akt信号传导途径，诱导G1期阻滞及细胞凋亡[4]。PTEN还对细胞外信号调节激酶（ERK）/丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号途径起负调节作用，抑制MAPK激酶的磷酸化,阻滞细胞生长周期于G1期，抑制肿瘤细胞生长[5]。同时，PTEN下调血管内皮生长因子 (VEGF)mRNA的水平以影响其分泌,从而调控肿瘤血管生长，进而影响其生长和转移。PTEN基因N端序列与整合蛋白转导复合体中的细胞骨架蛋白tensin有较高同源性，其突变失活形成配体—整合素—FAK—p130cas复合物，启动跨膜信号转导，调节细胞的粘连和迁移[6]。因此PTEN通过多种途径参与细胞生长调节、肿瘤的侵袭转移及血管发生，其突变和失活与肿瘤的恶性进展有关。研究发现PTEN在EECA中总的突变率为34%～80%[7]，突变的位点是磷酸酶结构域内的半胱氨酸突变为丝氨酸使磷酸酶活性全部丧失，影响蛋白质二级结构的残基。本实验观察了52例子宫内膜癌中PTEN的表达，27例（52%）为表达完全缺失；其中EECA45例，PTEN表达完全缺失占26例（57.8%）。在7例非EECA组织中仅有1例PTEN表达阴性，进一步证实了两型子宫内膜癌发生机制的不同。本研究中，PTEN表达阳性率在正常增生期子宫内膜组、增生症组和EECA组中呈渐进下降，实验中发现，在单纯增生过长子宫内膜或复杂增生过长子宫内膜中可见少量不等的PTEN表达阴性的腺体散在于阳性腺体中间；而在不典型增生内膜组织中，PTEN阴性腺体居多；在EECA合并有PTEN表达阴性的不典型增生内膜组织中，所有内膜癌腺体也都无PTEN蛋白表达。这种PTEN蛋白在不同子宫内膜病变组织中表达的渐变，提示PTEN阴性细胞克隆的扩增可能是在子宫内膜增殖过程中进行的[8]。这也佐证了PTEN蛋白表达缺失可能是子宫内膜癌病变的早期分子事件。目前，关于PTEN基因突变与Ⅰ型子宫内膜癌的临床病理特征之间的关系研究结果不一，杨琳琳等[9]发现PTEN蛋白表达与子宫内膜癌的组织学分级和肌层浸润有关。本研究发现PTEN蛋白表达在高分化EECA中的表达阳性率明显高于中-低分化，提示PTEN蛋白表达越低，肿瘤恶性程度越高，临床预后越差。综上，PTEN突变或表达缺失是Ⅰ型子宫内膜癌病变的早期分子事件，可能成为其早期诊断的一个生物学指标。

P27基因是1994年Polyak等发现的一种调控细胞周期并抑制细胞分裂的重要基因,定位于第12号染色体短臂1区3带 (12p13),其编码的蛋白P27kipl是一种非特异性多功能周期素依赖性激酶抑制剂（CDKI），通过抑制cyclin-CDK复合物的生物活性来调控细胞周期，最终导致肿瘤细胞在G1/S期停滞[10]。P27在人类肿瘤中的突变罕见,多表现为基因缺失和蛋白表达的异常,Masciullo等[11]研究发现P27在子宫内膜增殖过程中起到调控作用，其表达缺失是发展为子宫内膜癌的重要一步。本研究中P27蛋白在正常子宫内膜、增生症组以及Ⅰ型子宫内膜癌组织中的表达阳性率呈梯度下降，反映了P27表达缺失是随着由正常子宫内膜发展为子宫内膜癌的过程中不断积累的。Ⅰ、Ⅱ型子宫内膜癌中P27蛋白的表达差异显著，P27蛋白在EECA中的表达位于细胞核内；而在UPSC组织却定位于胞浆。说明P27蛋白表达定位于细胞核可能是其抑制肿瘤的前提条件[12]。Dellas等13]研究了225例子宫内膜癌患者发现P27表达缺失与肥胖的EECA患者预后相关。本次研究EECA中P27蛋白表达随着FIGO分期越晚和患者年龄越大其缺失率越高，提示P27与EECA预后相关。

P27作为细胞周期的负性调控因子，以化学计量方式与cyclinE-CDK2，cyclinD-CDK4复合物紧密结合，抑制其活性。抑癌基因PTEN抑制细胞生长的作用机制之一即是可促使P27组装进cyclinE/CDK2复合物中并提交P27蛋白水平,使CDK2活性下降,阻止细胞通过G1→S限制点。Cheney等[14]发现PTEN诱导的细胞周期停滞与P27的大量积聚有关，提出P27可能是PTEN通过PI3K/AKT信号传导途径调节细胞分化增殖，诱导G1期阻滞过程的下游靶基因。Erkanli等[15]通过研究29例EECA和38例子宫内膜增生症发现，P27与PTEN的表达呈正相关。本实验中，PTEN表达阴性的EECA中85%出现P27表达阴性，两者的表达呈明显正相关。进一步提示EECA中P27可能是直接或间接的PTEN介导的细胞周期停滞过程中的下游靶基因。

综上所述，PTEN作为EECA中突变率最高的基因，其蛋白表达降低或缺失，是EECA发生的早期分子事件；P27kipl可能是PTEN介导的细胞周期停滞过程中的下游靶基因，其蛋白表达缺失或降低可能与EECA患者临床预后相关。检测PTEN与P27的表达对于EECA早期诊断和预后判断的意义尚待进一步研究。

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