不同浓度铵态氮对苦草的生理影响

宋 睿,姜锦林,耿金菊,高士祥,王晓蓉(南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏南京 210046)

不同浓度铵态氮对苦草的生理影响

宋 睿,姜锦林,耿金菊,高士祥*,王晓蓉**(南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏南京 210046)

研究了苦草在不同浓度(0.02,0.05,0.10,0.30,0.60,1.00,3.00mg/L)铵态氮中暴露14d后,其生物量的变化、叶片游离氨基酸态氮、叶绿素、可溶性蛋白含量以及 O2-⋅信号强度、抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的响应.结果表明,各浓度组苦草的生物量无显著变化,但是各生理指标变化显著.当铵态氮浓度为0.30mg/L时,苦草叶片中游离氨基酸态氮的含量即开始显著升高.当铵态氮浓度达到0.60mg/L时,超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高,表明苦草诱导产生氧化应激但未受到氧化损伤.当铵态氮浓度高于1.00mg/L时,SOD和过氧化物酶(POD)活性显著升高,O2-⋅信号强度显著增强,叶绿素、可溶性蛋白含量显著降低.当铵态氮浓度为0.02mg/L时,O2-⋅信号强度显著增强.综上,铵态氮浓度低于0.60mg/L苦草生长良好,浓度≥1.00mg/L苦草光合能力受到抑制、代谢受到干扰.苦草对铵态氮最敏感的生理生化指标是叶片中游离氨基酸态氮含量.铵态氮作为沉水植物的一种营养物质,当其含量较低时,植物由于营养缺乏诱导产生自由基.

铵态氮；苦草；氨基酸态氮；叶绿素；可溶性蛋白；自由基；抗氧化酶

蓝藻水华生态灾害频发,严重威胁了区域水环境生态安全以及人民的健康[1].铵态氮是蓝藻水华成灾过程中产生的重要代谢衍生物,尤其在蓝藻水华暴发后期,大量的铵态氮释放到水环境中,对水生生态系统中重要的初级生产者——沉水植物产生极大的影响.已有研究表明[2],铵态氮是沉水植物生长所需要的重要营养物质,但是高浓度的铵态氮对沉水植物的生长有抑制作用,甚至会直接导致其消亡.高浓度的铵态氮抑制沉水植物的光合作用、诱导产生氧化应激并且导致植物体内碳氮代谢的不平衡[3-6].目前关于铵态氮对沉水植物生理影响的研究[3-5]大多集中于高浓度,其实验浓度高达 2～30mg/L.较低浓度铵态氮对沉水植物生理影响的研究鲜为报道.湖泊流域水质通报的监测结果表明,我国湖泊铵态氮的平均浓度≤1mg/L.因此,研究较低浓度铵态氮对沉水植物生理活动的影响,寻找铵态氮对沉水植物的安全浓度,进一步认识铵态氮导致沉水植物衰退的机理,更具有实际意义.

苦草(Vallisneria natans L.)是我国河流湖泊中分布最为广泛的一种沉水植物,其常被作为富营养化湖泊中沉水植物恢复重建的先锋种[7].本实验研究了在实验室模拟条件下,不同浓度铵态氮对苦草生物量、叶片游离氨基酸态氮、叶绿素、可溶性蛋白含量以及O2-⋅信号强度、抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的影响,为铵态氮对沉水植物的影响提供更多理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用苦草采自太湖胥口湾,挑选生长良好、株高(20±2)cm、重(6.5±0.5)g的植株移栽到 24个无色玻璃缸(长 15cm、宽 15cm、高25cm)中,每缸4株,玻璃缸底层铺有厚度5cm的石英砂,加入10%的Hoagland′s营养液预培养7d.

2-(环己胺)-1-乙磺酸(CHES)GR 级;1,2-二羟基-3,5-苯二磺酸二钠(Tiron)AR级;吐温-20AR级;氯化铵AR级.

1.2 实验处理

预培养结束后,将24缸苦草分为8组,设置 7组不同铵态氮(NH4Cl配置)浓度的营养液:0.02,0.05,0.10,0.30,0.60,1.00,3.00mg/L,同时设置一组无氮的对照组(CK).每组3个平行,每缸营养液定容至5L.所用营养液为Hoagland′s营养液去除含氮的部分,均用曝气 2d的自来水配制.将各组苦草放置于培养室中,控制培养室的温度(25±1)℃,模拟自然光照强度,光暗时间比为 12h∶12h.每天换水一次,并测定水中铵态氮、亚硝态氮、硝态氮的浓度.控制营养液的pH值7.8±0.2,DO≥4mg/L.14d后,取各组苦草叶片样品先用自来水冲洗干净、再用去离子水冲洗3次,用滤纸将苦草叶片表面的水吸干.称取部分样品用于自由基捕获,剩余样品保存于-80 ℃冰箱进行其余生理生化指标的测定.

1.3 测试指标与方法

1.3.1 O2-⋅的捕获与信号强度测定 O2-⋅的捕获与强度测定方法参考Lynch等[8]的方法略有修改.分别称取新鲜苦草叶片 0.1g,置于研钵中,加入适量液氮冷冻后,迅速置于充满氮气的密封箱中研磨成粉末,立即加入捕获剂1mL制成匀浆液,转移至离心管中.匀浆液在 4℃下,以 10000×g离心15min,转移上清液于离心管中,迅速于液氮中保存用于电子顺磁共振(EPR)测定.上述操作均在无氧条件下进行,并避免水分进入干扰测定.捕获剂pH 值为 8.6,其中含有0.05m⋅l/L CHES、0.01m⋅l/L Tir⋅n和0.5%吐温-20.EPR测定在常温(25℃)下进行,吸取 200μL上清液注入石英扁平槽中,采用Bruker EMX 10/12型EPR仪检测.检测条件为中心磁场:3480G;扫瞄宽度:200G;微波功率:20mW;调制频率:100kHz;调制幅度:1.0G;扫瞄次数:1次.

表1 铵态氮浓度对生物量、抗氧化酶活性和MDA含量的影响Table 1 Effect of NH4+-N concentrations on the biomass, activities of antioxidant defenses and contents of MDA

1.3.2 可溶性蛋白含量、酶活性和丙二醛含量测定 粗酶液的提取参照 García-Lim⋅nes 等[9]的方法略有修改.可溶性蛋白含量测定参照考马斯亮蓝染色法[10],以小牛血清蛋白(BSA)作为标准蛋白.超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[11];过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚氧化法[12-13],过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用紫外法[14].丙二醛含量的测定采用TBA比色法[15].

1.3.3 叶绿素和游离氨基酸态氮含量测定 叶绿素测定采用丙酮提取法[16].游离氨基酸态氮测定采用茚三酮法[17].

1.3.4 铵态氮、亚硝态氮、硝态氮浓度测定 铵态氮的测定根据标准《水质铵的测定水杨酸分光光度法》(GB7481-1987).亚硝态氮的测定根据标准《水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法》(GB7493-1987).硝态氮的测定根据标准《水质硝态氮的测定分二磺酸分光光度法》(GB7480-1987).

1.3.5 统计分析 实验结果表示为平均数±标准误差(Mean±SD).使用 SPSS15.0统计软件和ANOVA法将实验组与对照组数据进行显著性差异分析,使用Origin8.0统计软件处理自由基数据.

2 结果与分析

2.1 不同浓度铵态氮对苦草生物量的影响

由表 1可见,铵态氮浓度≥1.00mg/L时,14d后,苦草的生物量(鲜重)开始下降,但未出现显著性差异.当铵态氮浓度为 3.00mg/L时,苦草的生物量下降至对照组生物量的90%左右.

2.2 不同浓度铵态氮对苦草叶片游离氨基酸态氮含量的影响

由图1可见,随着铵态氮浓度的升高,苦草叶片中游离氨基酸态氮的含量先略有下降后又显著升高.当铵态氮浓度达到 0.30mg/L时,其含量已经接近对照组含量的 3倍,出现了显著性差异(P＜0.05).随着铵态氮浓度进一步升高,其含量显著上升,出现极显著性差异(P＜0.01).

2.3 不同浓度铵态氮对苦草叶片叶绿素含量的影响

由图2可见,随着铵态氮浓度升高,苦草叶片中叶绿素a和b的含量先升高后又显著下降.当铵态氮浓度为3.00mg/L时,叶绿素a和b的含量均下降到对照组含量的 60%左右,与对照组相比叶绿素a出现显著性差异(P＜0.05);叶绿素b出现极显著性差异(P＜0.01).

图1 铵态氮浓度对游离氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effect of NH4+-N concentrations on contents of amino acid-nitrogen

图2 铵态氮浓度对叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of NH4+-N concentrations on contents of chlorophyll

2.4 不同浓度铵态氮对苦草叶片可溶性蛋白含量的影响

由图3可见,随着铵态氮浓度的升高,苦草叶片中可溶性蛋白含量先升高后又显著下降的趋势.当铵态氮浓度为1.00、3.00mg/L时,苦草叶片可溶性蛋白含量显著下降,与对照组相比出现显著性差异(P＜0.05).

图3 铵态氮浓度对可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effect of NH4+-N concentrations on contents of soluble protein* P＜0.05

2.5 不同浓度铵态氮对苦草叶片 O2-⋅信号强度的影响

图4 EPR捕获不同浓度组O2-⋅的谱线Fig.4 The EPR spectrum of O2-⋅ of different concentrations

EPR捕获O2-⋅谱线如图 4所示,O2-⋅信号强度分析结果如图5所示.由图5可见,当铵态氮浓度为0.02mg/L时,苦草叶片中O2-⋅信号强度较对照组显著增强(P＜0.05).随着铵态氮浓度升高,叶片O2-⋅信号强度呈先减弱后增强的趋势,铵态氮浓度0.60mg/L处理组,叶片O2-⋅信号强度下降到对照组的 40%左右,出现极显著性差异(P＜0.01);随着铵态氮浓度的升高,其信号强度进一步增强,铵态氮浓度为3.00mg/L处理组,其信号强度是对照组的1.5倍,出现极显著性差异(P＜0.01).

图5 铵态氮浓度对O2-⋅自由基信号强度的影响Fig.5 Effect of NH4+-N concentration on O2-⋅ freeradical signal intensity* P＜0.05

2.6 不同浓度铵态氮对苦草叶片抗氧化酶活性以及MDA含量的影响

由表 1可见,当铵态氮浓度为 0.02mg/L时,SOD和 POD活性均略有升高但未出现显著性差异.随着铵态氮浓度的升高,苦草叶片中SOD和POD的活性均呈现先下降后升高的趋势.当铵态氮浓度为0.60mg/L时,与对照组相比SOD活性已出现极显著性差异.随着铵态氮浓度进一步升高至3.00mg/L时,SOD活性升高至对照组活性的 2倍左右,出现了极显著性差异(P＜0.01).当铵态氮浓度为1.00mg/L时,POD的活性已升高至对照组活性的 2倍左右,出现了显著性差异(P＜0.05).同时还观察到,铵态氮浓度为 0.05～0.60mg/L时,苦草叶片中CAT活性一直受到显著性抑制(P＜0.05).各实验组的MDA含量均低于对照组,并出现显著性差异(P＜0.05).

3 讨论

铵态氮是沉水植物正常生长发育所需要的营养物质.研究表明[18],当沉水植物缺少氮素营养时,蛋白质合成减少、细胞分裂减慢;而当氮素营养过剩时,也会对其产生伤害.本实验通过苦草在不同浓度铵态氮中暴露14d后,分析其生物量、叶片中游离氨基酸态氮、叶绿素和可溶性蛋白含量,以及O2-⋅信号强度、抗氧化酶活性和MDA含量,以期寻找适合苦草生长的铵态氮浓度.

一般来说,当水环境中 NH4+浓度较高时,沉水植物被动吸收大量NH4+之后,主要通过两条途径减少NH4+在植物细胞内的积累,一是通过主动运输并消耗能量将NH4+运出植物细胞,二是合成游离氨基酸[19].本实验结果表明,从铵态氮浓度为0.30mg/L开始,苦草叶片中游离氨基酸态氮含量显著升高,表明叶片中积累了大量的游离氨基酸从而减少NH4+的积累、减轻其毒害作用.CaO等[4]的研究得到类似结果,暴露苦草于 1.0mg/L铵态氮培养液中 2个月,发现苦草叶片中积累了大量的游离氨基酸.综合分析各生理生化指标表明,苦草对铵态氮最敏感的指标是叶片中游离氨基酸态氮的含量.植物叶片的叶绿素和可溶性蛋白含量是与其光合能力相关的重要生理指标.叶绿素a和b是吸收和传递光能的主要色素.本实验中,当铵态氮浓度为3.00mg/L时,叶绿素a和b的含量显著下降,并且肉眼可观察到轻微的缺绿病症状.尽管植物可以通过主动运输、氨基酸代谢等途径减轻 NH4+的压力,但是过量的 NH4+已经抑制了植物的光合作用、破坏了植物的光合作用系统.Britto等[20]的研究认为,由于过量的NH4+抑制了Mg2+的吸收和运输,所以造成了植物光合作用受到抑制,其作用机制还有待进一步的研究验证.植物叶片中的可溶性蛋白大多是参与各种代谢的酶类,其中约 50%是参与光合作用的关键酶.因此可溶性蛋白的含量,被广泛用作衡量叶片光合能力高低和衰亡的指标[21].本实验得到结果,从铵态氮浓度为1.00mg/L开始,苦草叶片的可溶性蛋白的含量显著下降,表明植物机体光合能力降低、代谢受到干扰,并且肉眼可观察到生物量明显减少、植物受损.

已有研究表明[3-5],高浓度的铵态氮会诱导沉水植物产生氧化应激,诱导植物体内抗氧化酶SOD、POD、CAT等活性发生变化.在高浓度铵态氮的胁迫下,植物体内活性氧水平升高,诱导抗氧化酶类的活性发生变化,从而清除活性氧并抵御胁迫.活性氧的水平超过抗氧化酶类的清除能力,植物体即受到了氧化损伤.SOD作为防御活性氧的第一道防线,主要作用是催化 O2-⋅转化为H2O2.CAT和 POD的作用是催化 H2O2分解成H2O和O2,CAT主要位于微粒体中,POD主要位于细胞质、细胞壁、液泡和细胞外空间[3-5].本实验表明,当铵态氮浓度为 0.60mg/L时,苦草叶片中O2-⋅信号强度显著下降,浓度为1.00mg/L时无显著性变化,主要原因是 SOD 活性显著升高,清除了一部分O-⋅.铵态氮浓度为 3.00mg/L时O-⋅

22信号强度显著升高,虽然此时SOD的活性仍然显著升高,但是 O2-⋅大量蓄积,可能因为自由基产生的速率超过了SOD的清除速率.铵态氮浓度达到1.00mg/L时,POD活性显著升高,主要是因为SOD催化O2-⋅转化产生大量的H2O2,POD活性受到诱导从而催化转化 H2O2.从铵态氮浓度为0.05～0.60mg/L,CAT活性受到抑制,可能由于积累的H2O2抑制了CAT的活性,但植物体并未受到氧化损伤.同时,结果发现当铵态氮浓度为0.02mg/L时,O2-⋅信号强度显著升高,但并未诱导抗氧化酶类活性产生显著变化,主要因为产生的自由基被及时清除并未诱导植物产生氧化应激.低铵态氮条件下 O2-⋅含量显著升高,可能因为植物处于营养缺乏状态,诱导了自由基的产生.Shin等[22]对拟南芥的研究得到类似结果,他测定了拟南芥在缺乏营养物质氮素的情况下其根部活性氧的水平,结果表明由于氮素的缺乏,拟南芥根部特定区域活性氧浓度升高.Shin等[23]研究了当拟南芥缺乏营养元素钾时,其根部的活性氧浓度也会升高;并且发现活性氧主要积累在根部钾离子吸收和转运较活跃的区域.本实验的研究证明了上述观点.MDA是多不饱和脂肪酸氧化的二级终产物,并已用于表征脂质过氧化的程度.在本实验研究的铵态氮浓度范围内,苦草叶片中 MDA含量显著降低.Wang等[3]的研究得到类似结果,他推测植物抗氧化能力提高可以减轻或者防止脂质过氧化反应.Nimptsch等[5]研究结果相似,他在研究铵态氮对沉水植物红狐尾藻的影响时发现暴露7d后,脂质过氧化产物MDA、4-HNE含量减少.他也认为由于活性氧的增加,植物体抗氧化能力提高,从而提高了分解脂质过氧化产物的能力,所以脂质过氧化产物含量减少.MDA的降低,究竟是由于植物体抗氧化能力提高、还是由于多不饱和脂肪酸含量减少或是沉水植物对铵态氮压力有不同的适应或防御机制,还需要进一步研究.

综合分析实验结果,各铵态氮浓度组生物量没有出现显著性变化.但是生理生化指标出现一系列早期响应,其结果表明铵态氮浓度≥1.00mg/L,苦草光合能力受到抑制、代谢受到干扰.

4 结论

4.1 铵态氮浓度低于 0.60mg/时苦草生长良好,浓度大于或等于1.00mg/L时苦草的光合能力受到抑制、代谢受到干扰.

4.2 苦草对铵态氮最敏感的生理生化指标是叶片中游离氨基酸态氮含量.

4.3 铵态氮作为沉水植物的一种营养物质,当其含量较低时,植物由于营养缺乏诱导产生自由基.

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Physiological effect of Vallisneria natans L. under different concentrations of ammonia.

SONG Rui, JIANG Jin-lin, GENG Jin-ju, GAO Shi-xiang*, WANG Xiao-rong**(State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse,School of Environment, Nanjing University, Nanjing 210046, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：448～453

The effects of biomass, nitrogen in free amino acids, chlorophyll, soluble proteins and malondialdehyde(MDA),intensities of O2-⋅ and antioxidant enzyme activities in the leaves of Vallisneria natans L. exposed to different concentrations of NH4+-N (0.02,0.05,0.10,0.30,0.60,1.00,3.00mg/L) after 14 days were investigated. No significant changes were observed for the biomass of leaves in the studied exposing level, while the physiological signals showed different trends. Intensities of O2-⋅ increased at the lowest concentration of ammonia(0.02mg/L). The nitrogen contents in the free amino acids started to increase significantly from 0.30mg/L NH4+-N. When the NH4+-N reached 0.60mg/L, SOD activities were significantly induced, indicating oxidative stress to the plant without oxidative damage. When the ammonia concentrations were higher than 1.00mg/L, the signal intensities of free radicals and activities of SOD and POD significantly increased, while the contents of chlorophyll and soluble protein decreased, indicating oxidative damage might happen. Generally, the plants grew well when the NH4+-N concentration was below 0.60mg/L and stress and growth disturbance happened when it was above 1.00mg/L. Among all those physiological parameters measured, the nitrogen content in the free amino acids in the plant leaves was the most sensitive indicator. Results also suggested that deficiency of nutrient at a low level of ammonia may cause the induction of free radicals in submerged plant leaves.

ammonia；Vallisneria natans L.；amino acid-nitrogen；chlorophyll；soluble protein；free radical；antioxidant enzymes

X503.23

A

1000-6923(2011)03-0448-06

2010-07-16

国家“973”项目(2008CB418102);水体污染控制与治理科技重大专项(2009zx07316-004)

* 责任作者, 教授, ecsxg@nju.edu.cn

** 责任作者, 教授, ekxr@nju.edu.cn

宋 睿(1986-),女,江苏淮安人,硕士研究生,主要从事环境毒理学研究.发表论文1篇.