解冻猪肉中优势腐败菌致腐能力研究

黎园园，董庆利*，梁 娜，熊 成

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

解冻猪肉中优势腐败菌致腐能力研究

黎园园，董庆利*，梁 娜，熊 成

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

将解冻猪肉中的优势腐败菌(假单胞菌属、热死环丝菌和肠杆菌科)接种到灭菌肉上研究其在不同温度贮藏过程中腐败的特点。在贮藏期间每天进行感官评价，测定各腐败菌的菌落数(CFU)、挥发性盐基氮(TVB-N)、脂肪氧化值，并以产生腐臭味时的TVB-N产量因子Y(TVB-N/CFU)作为各优势腐败菌腐败能力的定量指标。研究结果表明：至贮藏期第5天时解冻猪肉已产生强烈的腐臭味，热死环丝菌菌数在4、0℃和－5℃贮藏时分别达11.28lg(CFU/g)、9.63lg(CFU/g)和6.62lg(CFU/g)，而相应的TVB-N值分别达14.92、14.50mg/100g和9.10mg/100g；与之类似，假单胞菌属菌数4、0℃和－5℃贮藏时分别达9.46lg(CFU/g)、8.87lg(CFU/g)和5.37lg(CFU/g)，TVB-N值分别达21.59、14.49mg/100g和8.97mg/100g。研究表明热死环丝菌和假单胞菌属导致解冻猪肉腐败能力较强。

解冻猪肉；优势腐败菌；致腐能力

优势腐败菌是对猪肉腐败变质起主导作用的细菌。冻结猪肉在冻藏过程中优势腐败菌的生长受到抑制，解冻后各腐败菌又恢复活性，在解冻猪肉贮藏过程中会继续生长，并利用猪肉中的蛋白质、碳水化合物、脂肪等营养物质进行自身代谢，产生代谢产物如硫化物、胺类等，导致猪肉产生色泽、气味变化，表面黏连及产生黏液等感官变化，同时也会导致其pH值、持水性等相关理化性质发生变化。由于腐败菌导致解冻猪肉的品质降低，影响其加工和食用价值，有必要开展解冻猪肉中优势腐败菌腐败特性的研究。

国内外有不少学者对肉及肉制品的腐败微生物进行了研究。Borch等[1]研究了肉和加工肉制品中的腐败细菌，有假单胞菌属、不动杆菌属、热死环丝菌、肠杆菌科等。Li等[2]对冷却肉在贮藏过程中细菌多样性及主要菌群的变化进行了研究，确定了冷却肉中存在的主要菌群有节杆菌属、肠杆菌科、葡萄球菌、莫拉氏菌属、假单胞菌属、乳酸菌、气单胞菌属、不动杆菌属、热死环丝菌，其中假单胞菌属和热死环丝菌是托盘装冷却肉中存在的主要细菌。Hu等[3]研究了4℃贮藏条件真空包装火腿中腐败细菌的特征，发现存在大量的明串珠菌属和乳酸杆菌属。

目前研究主要集中在冷却肉及包装肉制品方面，而对解冻后肉的腐败研究较少，故本研究着重探讨解冻猪肉在不同贮藏温度条件下各优势腐败菌的腐败能力。通过将灭菌肉接种不同腐败菌并贮藏在不同温度条件下，定时取样检测感官指标及理化指标，研究其腐败特点，以期为肉类工业质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品与菌种

宰后48h的猪精腿肉购自上海市卜蜂莲花超市。假单胞菌属、热死环丝菌及肠杆菌科菌种为实验室分离鉴定后保存的菌种。

1.2 培养基与试剂

PCA培养基(plate count agar)、PSA培养基(pseudomonades selective agar)、STAA培养基(streptomycin thalliumacetate actidion agar)、VRBGA琼脂(violet red bile gluc agar)，培养基的配制参见文献[4]。

氧化镁混悬液(10g/L)、硼酸溶液(20g/L)、硫酸(c(1/2H2SO4)=0.01mol/L)标准滴定液、甲基红-乙醇指示剂(2g/L)、次甲基蓝-乙醇指示剂(1g/L)、α-硫代巴比妥酸溶液(0.02mol/L)、盐酸溶液(4mol/L)。

1.3 仪器与设备

Autoclave SS-325型灭菌锅 日本Tomykogyo公司；S·SW-CJ-IC型净化工作台、SPX-250B-Ⅱ型生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；XW-80A型漩涡混合器上海精科实业有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海华连医疗器械有限公司；HWS-150型恒温恒湿培养箱 上海比朗仪器有限公司；WAECO CF50型冰箱 美国电子(深圳)有限公司；WFJ7200型可见分光光度计 龙尼科(上海)仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 优势腐败菌菌液制备

取实验室保存的假单胞菌属、热死环丝菌和肠杆菌科菌株进行平板划线，在适宜温度条件下培养24h。取一环菌苔接种于300mL的液体培养基中培养12～18h，使菌液浓度达到108CFU/mL，经适当稀释后用于接种[5]。

1.4.2 无菌肉块制备

将猪精腿肉于超净工作台分割成50g左右大小，在酒精灯火焰上进行表面灭菌。经培养计数细菌总数＜102CFU/g，灭菌效果良好。

1.4.3 接种与贮藏

取制备好的各腐败菌菌液，经适当稀释，确定假单胞菌属、热死环丝菌和肠杆菌科的初始接种量分别为105、104CFU/mL和103CFU/mL，接种时间为10s。以未接种腐败菌的样品作为对照。接种后沥干菌液于无菌袋中保存，置于－18℃冻藏5d。取出在空气中(15℃)自然解冻3h，分别于4、0、－5℃贮藏5d。

1.5 测定指标

1.5.1 感官评价

采用10分制进行评分的猪肉感官指标包含色泽、质地和气味，10分为最好品质，2分为有表面暗红且有强腐臭味即腐败点[5]，评价标准如表1所示。

1.5.2 腐败菌菌落计数

采用选择性培养基对接种不同腐败菌的肉进行各种腐败菌的菌落计数。

1.5.3 挥发性盐基氮(TVB-N)测定

采用GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法测定[6]。

1.5.4 脂氧化(TBA)测定

参照Crackel等[7]的水蒸气蒸馏法方法测定，改进如下：取10g猪肉样品，加50mL蒸馏水，浸泡2min后用47.5mL水冲洗移入蒸馏烧瓶中，加2.5mL 4mol/L的盐酸，调节pH1.5，并加入几粒玻璃珠，然后加热蒸馏。沸腾10min后开始收集蒸馏物50mL。用移液枪移取5mL于具塞反应管中，加入5mL TBA试剂，用塞子封口，振荡并置于沸水中35min。用5mL蒸馏水作对照。然后将反应管于冷水中冷却10min，测定在波长538nm处的吸光度(A)。TBA值(以mg丙二醛/kg样品计)=7.8×A。

1.5.5 腐败能力的定量分析

将TVB-N产量因子Y(TVB-N/CFU)作为各优势腐败菌腐败能力的定量指标[5]，以接种到无菌肉块上的各腐败菌的TVB-N产量来表示。

表1 感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards for pork

2 结果与分析

2.1 贮藏中感官变化

图1 接种各腐败菌的解冻猪肉在－5℃贮藏过程中感官变化Fig.1 Sensory quality change of thawed pork incoluted with dominant spoilage bacteria during stroage

随着猪肉腐败程度的加剧，感官可接受性逐渐降低。对贮藏期内在不同温度贮藏的接种腐败菌的解冻肉样品进行感官评分。结果表明接种各腐败菌的解冻猪肉感官评分在贮藏过程中逐渐下降，在0℃及以上的条件下贮藏第5天时已达到腐败点；由图1可知，在－5℃条件下贮藏第5天时感官评分为8分，在可接受范围之内。且在3种贮藏温度条件下接种热死环丝菌和假单胞菌属解冻猪肉样品的感官评分低于肠杆菌科接种解冻猪肉，说明前二者致腐能力较强。

2.2 优势腐败菌菌落数变化

肉中细菌的数量是表示肉腐败程度的一个重要指标，不同温度条件下贮藏过程中各腐败菌菌落数及对照组菌落总数的变化分别如表2～4所示。

表2 4℃贮藏过程中各优势菌菌落数变化Table 2 Changes in the numbers of various dominant spoilage bacteria in thawed pork during storage at 4 ℃

如表2所示，4℃贮藏过程中各腐败菌菌落数及对照组菌落总数呈增加趋势，热死环丝菌菌落数第5天时最大(11.28lg(CFU/g))，相应的假单胞菌属和肠杆菌科分别为9.46lg(CFU/g)和9.73lg(CFU/g)，均比对照组菌落总数大。

表3 0℃贮藏过程中各优势菌菌落数变化Table 3 Change in the numbers of various dominant spoilage bacteria in thawed pork during storage at 0 ℃

如表3所示，0℃贮藏时各腐败菌的菌落数变化情况与4℃贮藏时类似，热死环丝的菌落总数平均值第5天时最大(9.63lg(CFU/g))，在贮藏过程中各腐败菌菌落数呈增加趋势。

表4 －5℃贮藏过程中各优势菌菌落数变化Table 4 Change in the numbers of various dominant spoilage bacteria in thawed pork during storage at － 5℃

如表4所示，－5℃贮藏过程中，各菌的菌落总数均没有显著增加的趋势，基本保持平衡，说明－5℃时细菌的生长受到了抑制。

2.3 贮藏中TVB-N值变化

挥发性盐基氮(TVB-N)是指肉及肉制品水浸液在碱性条件下能与水蒸气一起蒸馏出来的总氮量，是评价肉制品新鲜度的一项重要指标，挥发性盐基氮是由于微生物感染并繁殖，进入肌肉组织内部，并分泌一系列酶从而引起脱氨、脱羧作用，导致蛋白质分解而形成的产物[8]。不同温度贮藏过程中接种不同腐败菌的肉样TVB-N变化情况分别如表5～7所示。

表5 4℃贮藏过程中接种各优势菌对TVB-N值的影响Table 5 Effect of inoculated dominant spoilage bacteria on TVB-N value in thawed pork during storage at 4 ℃

由表5可知，接种腐败菌的肉样在4℃贮藏期间TVB-N值逐渐增大，接种肠杆菌科的肉样第5天时TVB-N值达到23.86mg/100g，其次是接种假单胞菌属的肉样，为21.95mg/100g，且接种腐败菌的各组样品的TVB-N值均显著高于对照组，说明腐败菌的生长繁殖是导致TVB-N产生的主要因素。

表6 0℃贮藏过程中接种各优势菌对TVB-N值的影响Table 6 Effect of inoculated dominant spoilage bacteria on TVB-N value in thawed pork during storage at 0 ℃

由表6可知，0℃时变化趋势与4℃类似，但是贮藏期末的最高值要小于4℃贮藏时，如接种假单胞菌属的肉样TVB-N值为14.49mg/100g，小于4℃时的21.59mg/100g。温度变低微生物的活动受到一定的抑制，故而产生的TVB-N就减少。

表7 －5℃贮藏过程中接种各优势菌对TVB-N值的影响Table 7 Effect of inoculated dominant spoilage bacteria on TVB-N value in thawed pork during storage at － 5℃

从表7可以看出，各组的TVB-N值在贮藏期间都没有显著的变化，且与对照组没有显著差异，可见－5℃条件下，腐败菌处于抑制状态，活性很低，基本不会引起肉的腐败。

2.4 贮藏中TBA值变化

脂氧化是导致肉腐败的主要原因之一，会破坏脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸。在肉品的贮藏过程中，脂氧化导致肉的色泽、气味、滋味、质地及营养价值发生改变。脂氧化是由于自由基催化作用产生的，氢过氧化物(ROOH)是一种重要的产物，极不稳定，存在的时间很短，很快降解形成丙二醛(MDA)、戊醛、己醛和4-羟基壬醛等物质[9]。本实验选择TBA法测定肉品中脂肪氧化程度，接种腐败菌肉样在4℃贮藏温度条件下TBA值变化如图2所示。

图2 接种腐败菌解冻肉在4℃贮藏温度条件下的TBA值Fig.2 Change in TBA value of thawed pork inoculated with dominant spoilage bacteria during storage at 4 ℃

图2表明在不同贮藏温度条件下，接种腐败菌的解冻肉样品的TBA值在贮藏过程中呈增大趋势，说明只要有氧存在，脂自动氧化都会发生。由图2可以看出，在4℃贮藏时接种假单胞菌属和热死环丝菌肉样的TBA值较大，显著高于接种肠杆菌科和对照组；接种肠杆菌科的肉样的TBA值显著高于对照组：说明这3种菌对脂氧化有较大影响，且假单胞菌属和热死环丝菌对脂氧化有显著影响，但是在0℃和－5℃贮藏时，结果不显著(数据未列出)，分析原因可能因为贮藏温度较低。

2.5 贮藏中各腐败菌腐败能力定量分析

不同腐败菌的致腐能力差异源于腐败菌利用肉中的营养物质产生代谢产物的能力不同，本实验以TVB-N产量因子作为腐败能力定量分析的指标(表8)。

表8 不同贮藏温度条件下腐败菌腐败能力定量分析Table 8 Quantitative analysis for spoilage capability of dominant spoilage bacteria during storage at different temperatures

由表8可以看出，不论是4、0℃还是－5℃贮藏，接种假单胞菌属的Y(TVB-N/CFU)值较大，说明假单胞菌属腐败能力比热死环丝菌和肠杆菌科较为显著。

3 讨论与结论

本研究对贮藏期内接种各腐败菌的解冻猪肉进行感官评定，结果表明接种假单胞菌属和热死环丝菌的肉样所得评分明显低于接种肠杆菌科细菌和对照组，具体表现为颜色暗红、无光泽、且产生黏液较多。可通过进一步研究制定感官拒绝值作为腐败能力参考指标之一。

微生物的生长是引起肉腐败的主要原因，因此微生物的数量是衡量肉腐败程度的一个重要指标，本实验对贮藏期内接种腐败菌的肉样的菌落数进行了检测，结果表明4、0℃贮藏时接种到肉样的特定腐败菌均有显著增长，且假单胞菌属和热死环丝菌增长较快，尤其热死环丝菌，在贮藏期末达到最大。这与Russo等[10]、Nel等[11]研究肉中腐败微生物生长状况一致。

TBA和TVB-N是检测肉的新鲜度的重要指标。彭勇[12]、李苗云等[8]的研究表明随着猪肉贮藏时间的延长，TVB-N值逐渐增大。本实验结果显示，4℃贮藏时接种假单胞菌属和肠杆菌科肉样TVB-N值增加很快，超过20mg/100g；0℃时，接种热死环丝菌和假单胞菌属肉样的TVB-N值增加较快，达到14mg/100g左右。本研究将TVB-N与菌落数结合，用TVB-N产量因子Y(TVB-N/CFU)表示各腐败菌的腐败能力，结果表明假单胞菌属的腐败能力较强。有研究也采用TBA产量因子X(TBA/CFU)作为腐败能力指标之一[5]，因本实验TBA值变化不显著，并未采用此指标。

综上所述，将各腐败菌接种到无菌的肉块上，冻结解冻后研究其腐败特性。通过研究解冻肉腐败过程中的微生物指标和理化指标，对不同腐败菌造成的理化指标的变化进行比较，热死环丝菌和假单胞菌属的腐败能力较强，肠杆菌科在4℃导致腐败也比较快。

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Spoilage Capability of Dominant Spoilage Bacteria in Thawed Pork

LI Yuan-yuan，DONG Qing-li*，LIANG Na，XIONG Cheng
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

In order to explore the spoilage characteristics of dominant spoilage bacteria, Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta and Enterbacteriaceae were inoculated into sterilized pork at different storage temperatures of 4, 0 ℃ and － 5 ℃.Sensory evaluation score, aerobic bacteria count, total volatile basic nitrogen (TVB-N) value and thio-barbituric acid (TBA) value were determined on each storage day. Bacterial poilage capability was evaluated based on TVB-N production factor Y(TVB-N/CFU), which was calculated from TVB-N value divided by colony forming unit (CFU). The results indicated that strong spoilage odor occurred on the 5th storage day. The counts of B. thermosphacta in thawed pork were 11.28 lg(CFU/g),9.36 lg(CFU/g) and 6.62 lg(CFU/g) at storage temperatures of 4, 0 ℃ and － 5 ℃, respectively; while TVB-N values were 14.92, 14.50 mg/100g and 9.10 mg/100g, according to relative storage conditions. Similarly, the counts of Pseudomonas spp. were 9.46 lg(CFU/g), 8.87 lg(CFU/g) and 5.37 lg(CFU/g) under the storage temperature of 4, 0 ℃ and － 5 ℃, respectively; while TVB-N values were 21.59, 14.49 mg/100g and 8.97 mg/100 g, respectively. This study showed that B. thermosphacta and Pseudomonas spp. were dominant in thawed pork, with significantly stronger spoilage capability than others dominant bacteria.

thawed pork；dominant spoilage bacteria；spoilage capability

TS201.3

A

1002-6630(2011)05-0123-05

2010-07-18

国家自然科学基金项目(30800864)；上海市研究生创新基金项目(JWCXSL1002)

黎园园(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为畜产品安全与质量控制。E-mail：nishang1015@yahoo.com.cn

*通信作者：董庆利(1979—)，男，副教授，博士，研究方向为畜产品安全与质量控制。E-mail：dongqingli@126.com