复配“三酶一素”抑制剂的美白功效评价

周梅，肖军，徐艺钊，曾日红

（中山市嘉丹婷日用品有限公司，广东 中山 528415）

复配“三酶一素”抑制剂的美白功效评价

周梅，肖军，徐艺钊，曾日红

（中山市嘉丹婷日用品有限公司，广东 中山 528415）

本文用细胞生物学法及细胞图像分析法对由光甘草定和MSH复配的美白剂“三酶一素”抑制剂的美白效果进行了评价。实验结果显示，“三酶一素”抑制剂对黑色素形成过程中各个阶段的酶均能起到抑制作用。通过电镜观察，使用“三酶一素”抑制剂可减少黑色素细胞和黑色素瘤B16细胞，美白效果明显。

美白；三酶一素；MSH；光甘草定

近年来，皮肤美白类化妆品的开发日趋活跃，销售快速增长，美白产品已成为许多爱美女性必备的化妆品。然而，随着美白化妆品的广泛使用，暴露出来的问题也越来越引人关注。传统皮肤美白产品中往往添加了过氧化氢、氯化铵基汞以及各种酚类衍生物等化合物，其作用机理是促使黑色素组织迅速瓦解，从而起到快速美白之功效。但这些成分对皮肤具有腐蚀性、细胞毒性和过敏性，长期使用具有极大的危害性，许多国家包括我国均已禁用。

通过抑制黑色素的合成来达到美白效果是当今美白产品发展的方向。目前，熊果苷、曲酸、维生素C以及它们的衍生物等已被广泛应用于美白产品中，取得了一定的效果。但是，上述美白活性成分的渗透率较低，功效不够理想，配方师往往通过添加大量美白剂来增强效果，但仍难以满足消费者的需求。同时，随着添加量增大，产生了许多安全隐患。例如，研究表明长期应用曲酸会引起接触性皮炎和红斑反应，并可能诱发妇女乳腺癌，曾在日本和台湾地区引起极大关注；熊果苷则是通过释放氢醌来达到美白效果，而后者的细胞毒性很大，已被禁止应用于化妆品中[1,2]。这些成分还容易导致化妆品的质量问题：熊果苷应用于配方中易引起产品变色；曲酸会与许多金属离子螯合，特别是铁离子产生着色的复合物，与空气接触缓慢氧化，在高温下还能加速。维生素C及其衍生物存在容易氧化或吸收困难等缺点。

为此，研究和开发安全性好、质量稳定、能满足消费者功效要求的美白产品，已成为化妆品业界亟需解决的热门课题。本文根据黑色素形成机理，采用细胞生物学法及细胞图像分析法，对由光甘草定和十一碳烯酰苯基丙氨酸（商品名MSH）复配的美白剂“三酶一素”抑制剂进行了美白效果评价。

1 实验部分

1.1 黑色素的形成机理

正常状态下人的肤色取决于黑色素的含量及其分布，美白的核心内容就是抑制黑色素的形成[1-2]。黑色素通常包括三种类型：DHI黑色素，DHICA黑色素和P H E O黑色素。D H I黑色素和D H I C A黑色素合称优黑素（Eumelanin），也有人称为真黑素；P H E O黑色素称脱黑色素（Pheomelanin），也有人称为褐黑素。

DHI黑色素是三种色素中颜色最深的一种，呈黑色到暗棕色，其相对分子质量最大，且不溶于酸碱。它由酪氨酸酶催化氧化而来，是人们通常所讲的黑色素。DHICA黑色素的颜色比DHI黑色素稍浅，呈棕色，且相对分子质量也比DHI黑色素小，微溶于酸碱。PHEO黑色素颜色最浅，呈黄色到红棕色，其相对分子质量最低，可溶于碱。

黑色素形成的生理过程可基本概括为：黑色素细胞产生黑色素；黑色素颗粒通过黑色素细胞树枝状突起向角朊细胞转移；转移至角朊细胞的黑色素颗粒随表皮细胞上行至角质层，并随着角质层脱落而排泄。其形成机理[3]如图1所示。

白种人皮肤含褐黑色素居多，肤色较浅。黄种人的皮肤以优黑色素居多，肤色较深，因此其美白的主要途径是抑制优黑色素的形成。研究表明，α-促黑细胞激素、酪氨酸酶、多巴互变酶（TRP-2）、DHICA氧化酶（TRP-1）（简称“三酶一素”）在黑色素的形成过程中起着重要的作用[1]，抑制“三酶一素”的生成是实现美白功能的关键。

1.2 “三酶一素”抑制剂——复配美白剂的美白机理

当前我国化妆品市场上的美白剂几乎都以抑制酪氨酸酶的活性为主。由于抑制机理单一，再加上活性物的渗透性不理想，使得产品的美白效果较差。而且这些美白剂具有很大的刺激性和致敏性，过量残留在皮肤上会给消费者带来一些安全隐患。目前，国内外还没有一种美白产品利用单一美白剂就能达到同时抑制α-促黑细胞激素、酪氨酸酶、TRP-2和TRP-1的目的，因此多种美白剂复配使用才能同时抑制“三酶一素”。MSH和光甘草定（Glabridin）是两种应用于美白化妆品中的最新化合物，本实验选择由MSH和光甘草定复配美白剂。

1.2.1 MSH的美白机理

MSH是促黑色素细胞激素α-MSH分子的有效拮抗剂，它作用于因α-MSH引发的黑色素形成的各个阶段的生化反应，从而抑制黑色素的形成。与抑制酪氨酸酶的传统美白剂（如熊果苷、曲酸等）不同，MSH通过非抑制酪氨酸酶的途径来阻止黑色素的产生，而且与其他美白剂配合使用效果更好。MSH在2%用量内是安全无刺激的，对光、热均非常稳定，溶于水，可以直接加入到水相中参与乳化[4-6]。

图1 黑色素的形成机理

1.2.2 光甘草定的美白机理

光甘草定（4-[(3R)-8,8-Dimethyl-3,4-dihydro-2H-pyrano [6,5-f]chromen-3-yl]Ben-Zene-1,3- diol）从特定品种的甘草中提取，是目前世界上公认最有效的天然美白剂。它能抑制酪氨酸酶的活性，又能抑制多巴色素互变和DHICA氧化酶的活性，是一种快速、高效、绿色的美白祛斑化妆品添加剂，具有与SOD（过氧化物歧化酶）相似的清除氧自由基的能力，以及与维生素E相近的抗氧自由基能力，还具有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、吸收紫外线、美白亮肤、祛斑的作用。光甘草定目前已在化妆品行业大量使用，如在膏霜、水、露、乳液等产品中都得到广泛应用[7-9]。

2 结果与讨论

2.1 用细胞生物学法测试“三酶一素”抑制剂的美白效果

化妆品行业的研发专家注意到，MSH与光甘草定在美白方面各自有其独到的优势，两者的抑制机理各有不同，但价格都相当昂贵，应用起来成本压力很大，因而难以推广。如果将其加以复配，就能够发挥协同效应，从而既能够增强美白效果，还可以降低生产成本，生产出满足社会需要的美白产品，并产生巨大的经济和社会效益。光甘草定和MSH的最佳复配比例为0.01:1.0[10]，此次实验中美白剂照此配比进行复配。

2.1.1 复配美白剂对促黑细胞激素（α-MSH）的抑制作用的测定

脑下垂体能分泌黑色素细胞刺激激素（α-MSH），它与Ⅰ型α-促黑色细胞激素受体（简称MC1R）结合后，通过激活环单磷酸腺苷和蛋白活化酶A来激活酪氨酸酶，促进黑色素的形成。有报道[3]指出，它还能促进黑色素细胞的分裂增殖。本实验的机理是复合美白剂中的成分通过争夺I型α-促黑色细胞激素受体，使得α-MSH失去受体而不能表达。

按照SEPPIC公司推荐的方法，从小鼠的黑素细胞B16/F1中提取MC1R，将MC1R放在有放射性配体（与MC1R受体有很高的亲和性）的四个培养箱中培养，控制培养环境。然后分别将复配美白剂、曲酸、Vc棕榈酸酯和熊果苷四种产品等量放入上述四个培养箱中观察反应，实验发现部分产品能与MC1R受体结合并且替代了放射性配体与MC1R受体的结合位置。根据取代位多少计算产品对MC1R受体的争夺率，结果见图2。

从图2可以看出，在争夺α-MSH受体方面，与其他市场上常用美白剂相比，复配美白剂对促黑细胞激素有更好的抑制效果，争夺率大于80%。

2.1.2 复配美白剂对酪氨酸酶的抑制作用的测定

黑色素的形成过程中酪氨酸酶是主要限速酶，在从酪氨酸向多巴转化和多巴向多巴醌转化过程中，都是由酪氨酸酶催化进行的。酪氨酸酶直接控制着黑色素合成的起始及速度，决定了后续步骤是否能够进行下去。因此，阻止酪氨酸酶的合成是实现美白的关键步骤之一。实验按照姚莉等人[11]的方法测定了复配美白剂抑制酪氨酸酶的活性（结果见图3）。

由图3可以看出，美白剂在极低的浓度下也会有很好的抑制酪氨酸酶的效果，这为提高产品的安全性提供了很大的保障。

图2 0.1%美白剂争夺MC1R实验

2.1.3 复配美白剂对TRP-2的抑制作用

TRP-2是一种与酪氨酸酶有关的蛋白质，其作用机理是促使所作用的底物发生重排，生成底物的某一同分异构体，最终生成另一黑色素。即在多巴色素脱羧、重排生成5,6-二羟基吲哚（DHI）的同时，黑色素细胞内部多巴色素由于多巴色素异构酶的存在而发生重排，生成5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）。因此，该酶主要是调节DHICA的的生成速率，从而影响所生成黑色素分子的大小、结构和种类。

实验采用液相色谱的方法（C18-ODS柱）测得复配美白剂在抑制TRP-2方面有很高的活性（表1）。抑制率＝1－有复配美白剂时的DHICA峰÷没有复配美白剂时的DHICA峰。

由表1可以看出，在0.5×10-3mg/mL和0.5×10-10mg/mL两种浓度下，复配美白剂对TRP-2的抑制率相同。因此，实验只需要少量美白剂便可达到高效抑制率，增加了产品的安全性。

2.1.4 复配美白剂对TRP-1的抑制作用

近年来对TRP-1（DHICA 氧化酶）功能的研究证明，该蛋白在黑色素合成的下游途径中起重要作用。它能催化DHICA，最终合成DHICA黑色素，TRP-1主要通过氧化DHICA来最终合成黑色素[1]。按照Kawaguchi等人[5]的方法，使用等量复配美白剂进行TRP-1抑制实验，结果如图4。

由图4可以看出，三种美白剂中，复配美白剂的抑制效率最高。结果表明复，配美白剂在抗氧化性上有非常显著的作用。

表1 复配美白剂对多巴互变酶的抑制

图3 复配美白剂抑制酪氨酸酶活性曲线

图4 复配美白剂对DHICA氧化酶的抑制作用

2.2 用细胞图像分析法测试“三酶一素”抑制剂的美白效果

用电镜观察使用复配美白剂5天后对体外培养的黑色素细胞的影响和对B16细胞形态的影响，结果见图5和图6。

对比图5中未使用复配美白剂的对照组和使用了复配美白剂的产品组，可以看出，使用复配美白剂5天后黑色素细胞明显的减少，对皮肤的美白效果明显。

由图6可以看出，使用复配美白剂5天后黑色素瘤B16细胞的数目明显减少，美白效果显著。

图5 美白剂对人皮肤色素细胞的影响

图6 复配美白剂对B16细胞形态的影响

3 结论

“三酶一素”抑制剂应用在美白护肤品中，对黑色素形成的各个阶段所需要的酶进行阻断。从生物细胞水平和细胞图像分析可知，复配的“三酶一素”抑制剂具有明显的美白效果。美白剂用量较少，不仅可以提高产品的安全性和功效性，而且能够极大地降低产品成本，增强企业的市场竞争力。

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