新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺研究

冯文文,李国玉,谭勇,王航宇,王金辉,2

(1石河子大学药学院/教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室,石河子832002;2沈阳药科大学中药学院,沈阳110016)

新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺研究

冯文文1,李国玉1,谭勇1,王航宇1,王金辉1,2

(1石河子大学药学院/教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室,石河子832002;2沈阳药科大学中药学院,沈阳110016)

为了确定新疆紫草中萘醌类成分的最佳提取工艺,本研究以新疆紫草中主要萘醌类成分的含量为指标,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定其含量,采用L9(34)正交实验进行提取工艺全面优选。结果显示,最佳提取工艺为:新疆紫草粗粉,用12倍量95%乙醇冷浸8 h。采用冷浸法提取新疆紫草中萘醌类成分,操作简便,方法可行,降低了生产成本,提高了药材利用率,使实验结果具有实际应用价值。

新疆紫草;萘醌;正交设计法;高效液相色谱

紫草(Radix A rnebiae,Radix L ithospermi)为紫草科植物新疆紫草 A rnebia euchroma(Royle)Johnst、紫草 L ithospermum erythrorhizonSieb.et Zucc.或内蒙紫草 A rnebia guttataBunge的干燥根 ,其味甘、咸 ,性寒 ,归心 、肝经 ,有凉血 、活血 、解毒透疹的功效[1]。现代药理实验表明紫草具有抗肿瘤[2-3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、保肝护肝[6]等多种药理活性,萘醌类成分为其主要的活性成分,故其含量高低必定影响药品质量。紫草萘醌类成分极性较小,易溶于石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂和植物油。王阳等[7]采用麻油作为提取溶剂,用均匀设计来优化紫草素的提取工艺,结果表明130～135℃提取13～39 min为最佳提取工艺。油炸法虽然安全性较高,但萘醌类化合物在温度大于80℃时稳定性急剧下降,容易遭到破坏[8],所以萘醌类成分提取时控制温度很重要,冷浸法、渗漉法[9]等提取方法的应用可以保证紫草色素的稳定性。

本实验以新疆紫草中9种主要萘醌类成分为指标,比较了不同浓度乙醇和超声法、冷浸法、渗漉法3种提取方法对紫草萘醌类成分的提取效果,并采用正交设计法考察、建立了冷浸法提取萘醌成分的最佳工艺,可为新疆紫草的深度开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆紫草2007年采自新疆天山,经生药学鉴定为新疆紫草(A rnebia euchroma(Royle)Johnst)的根 ,粉碎后过筛备用。萘醌对照品(1、2、3、4、5、6、7、8、9)均为本实验室自制 ,经 UV、HR-MS、NMR鉴定,HPLC测定纯度均在99%以上。液相用乙腈、甲醇均为色谱纯,购自J.T.Baker Co.Ltd(USA),乙醇为95%医用乙醇,水为重蒸水,其余试剂为分析纯。

Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);SK5200HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限责任公司);AR1140电子分析天平Sartorius(北京赛多利斯仪器系统有限公司);鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 新疆紫草萘醌类成分含量测定方法的建立

新疆紫草中萘醌类成分在波长274 nm、517 nm处均有着较强的紫外吸收,且无干扰,在进行提取工艺考察时,利用RP-HPLC法测定新疆紫草提取液中萘醌类成分的含量[10],对新疆紫草中萘醌类成分的提取工艺进行评价。

1.2.1.1 干膏量测定

参照2005年版《中国药典》附录XA浸出物测定法,精密量取相当于新疆紫草3 g的药液,置于已干燥恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3 h,移于干燥器中冷却30 min,迅速精密称定重量,计算干膏重量。

1.2.1.2 药材中萘醌的含量测定

色谱条件:色谱柱为 Scienhome Kromasil C18(4.6 mm×200 mm,5μm)及预柱,流动相为乙腈(A)-0.3%磷酸水(B),梯度洗脱过程(A梯度)0～10 min 70%,10～30 min 70%～75%,30～31 min 75%～95%,31～36 min 95%,36～37 min 95%～70%,37～50 min 70%。检测波长274 nm,柱温30℃,流速1.0 mL/min,理论板数萘醌计不低于3000。

药材的测定:取新疆紫草粗粉约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,摇匀,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,用微孔滤膜(0.22μm)滤过,按前述色谱条件进样10μL分析。

1.2.1.3 样品中萘醌的含量测定

将新疆紫草提取液过滤,定容后精密量取滤液1 mL用甲醇定容至10 mL容量瓶中,微孔滤膜过滤,取滤液,按1.2.1.2色谱条件,进样 10μL,计算其中九种萘醌总含量、质量分数,然后按下式计算萘醌的收率。

1.2.2 萘醌类成分提取工艺研究

1.2.2.1 提取溶剂的考察

根据萘醌类成分的理化性质,结合临床常规应用方法,本文考察了95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇对萘醌成分的提取效果。精密称取新疆紫草粗粉1.0 g,加入100 mL提取溶剂,超声处理30 min,提取液过滤,取滤液,按1.2.1.2项下色谱条件,测定提取液中萘醌的含量,并计算萘醌收率。

1.2.2.2 提取方法的比较

根据萘醌类成分对热不稳定的性质,本文没有采用回流提取、索式提取等热提取方法,而是对超声法、冷浸法(室温20℃)和渗漉法等冷提方法提取萘醌类成分的效果进行了比较。精密称取5.0 g新疆紫草粗粉以15倍量95%乙醇提取,比较不同提取方法对萘醌收率的影响,平行操作3份,计算萘醌平均收率。

1.2.2.3 正交设计法优选萘醌类成分的最佳提取工艺

在萘醌类成分的提取工艺研究过程中,拟对乙醇浓度、乙醇用量以及提取时间的不同水平进行考察,以便寻找出最佳提取工艺参数。具体因素水平的设计详见表1。

精确称量新疆紫草粗粉5.0 g,按L9(34)设定具体工作安排表进行实验,测定并计算萘醌收率,结果用极差法及方差法进行分析。

表1 正交设计因素水平Tab.1 Factors and level in the cold-infuse extraction

1.2.2.4 验证实验

采用以上确定的最佳条件进行三批验证实验,即以10.0 g新疆紫草药材,按最佳提取工艺进行提取,测定并计算萘醌平均收率。

2 结果与分析

2.1 新疆紫草萘醌类成分的含量测定方法

结果显示新疆紫草药材中9种萘醌化合物含量之和为6.264 mg/100mg。

萘醌对照品 HPLC色谱图见图1,2。

按1.2.1.2中色谱条件对新疆紫草进行分析,

图1 萘醌对照品HPLC色谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards

图2 新疆紫草供试品HPLC色谱 Fig.2 HPLC chromatograms of Radix Arnebiae

2.2 萘醌类成分提取工艺研究

2.2.1 提取溶剂的考察

95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇超声提取 30 min,萘醌收率分别为 99.80%、97.56%、33.09%。由此可知95%乙醇对紫草萘醌提取效率最高,70%乙醇的提取效率次之,50%乙醇对萘醌的提取率急剧下降。

2.2.2 提取方法的比较

各提取方法萘醌类成分收率如表2所示:渗漉法＞冷浸法＞超声法。

表2 不同提取方法提取萘醌类成分效果的比较Tab.2 Comparation of results of different extraction methods in naphthaquinones extracting

冷浸法是常用的提取方法之一,新疆紫草中萘醌类成分对光、热不稳定,冷浸提取有利于保护萘醌成分的稳定性。

由表2结果可知,本实验采用的3种提取方法对萘醌类收率均大于90%,且差别不大。超声提取与冷浸提取相比,虽提取时间短,但收率略低,有文献报道超声大于半小时对新疆紫草中萘醌成分会有影响,且超声提取对设备要求高,能耗大;冷浸法收率虽然稍低于渗漉法,但综合比较来看,冷浸法作为提取萘醌类成分初始提取方法,可以节约能源,而且对设备要求低,操作简便,转移率高,更适用于工业化生产。

2.2.3 正交设计法优选萘醌类成分最佳提取工艺

按L9(34)设定具体工作安排表进行实验,考察冷浸法提取紫草萘醌类类成分的最佳工艺参数,具体结果见表3、表4。

表3 正交设计试验安排及直观分析结果Tab.3 The design and results of the orthogonal test

表4 正交设计方差分析结果Tab.4 Variance analyzed in the orthogonal test

根据极差R的大小,其影响因素顺序为A＞C＞B,即乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量。由直观分析可知最佳工艺为A1B2C2,即乙醇浓度为95%、乙醇用量为12倍、提取时间16 h。

根据对方差和极差的综合分析可以发现,乙醇浓度是新疆紫草冷浸工艺的最主要影响因素,故95%为最佳冷浸浓度;提取时间为次要影响因素,8 h与16 h提取量相差较小,从节约时间方面考虑,采取冷浸提取8 h;本实验考察的乙醇用量对萘醌收率的影响最小,通过直观分析,优选12倍量乙醇。综上所述,我们筛选的冷浸法最佳工艺为A1B2C1,即:药材粗粉,12倍量95%乙醇溶液,冷浸8 h后,过滤并收集冷浸液即得。由于A因素已经是95%乙醇,大生产上无法使用更高浓度的乙醇,故关于此因素的追加试验舍去。

2.2.4 验证实验

采用以上确定的最佳条件进行三批验证实验,即以10.0 g新疆紫草药材,按最佳条件冷浸提取,过滤并收集冷浸液,测定结果见表5,其中萘醌平均收率为86.8%,重复试验 RSD值小于2%。

实验结果与正交实验中的最佳工艺相比相差较小,故从时间、能源各方面综合考虑,认为 A1B2C1(药材粗粉,12倍量95%乙醇溶液,冷浸8 h后,过滤并收集冷浸液)为紫草萘醌冷浸提取法最佳工艺。

表5 验证实验Tab.5 Varifying test in the cold-infuse extraction

3 结论

直观分析和方差分析结果表明各因素对萘醌类成分冷浸提取的影响大小依次为乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量。其中乙醇浓度对萘醌收率有显著影响,其他因素无显著影响。根据缩短生产周期,降低生产成本的原则,得出新疆紫草萘醌成分冷浸法提取的最佳工艺为:药材粗粉,采用12倍量95%乙醇冷浸8 h,过滤并收集冷浸液即得。按最佳工艺条件进行3次重复验证试验,结果表明该最佳提取工艺具有良好的重现性。

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Extraction Process of Naphthaquinones inRadix Arnebiae

FENG Wenwen1,LI Guoyu1,TAN Yong1,WANG Hangyu1,WANGJin-hui1,2
(1 School of Pharmacy,Shihezi University/Key Laboratory of Phytomedicine Resources&Modernization of TCM,Shihezi 832002,China;2 School of Traditional Chinese Materica Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China)

To study the best extraction method of naphthaquinones in Radix Arnebiae.The extraction process was studied by orthogonal design with the contents of naphthaquinones determined by RP-HPLC as index.The best method of extraction is coldsoaking with 12 times 95%alcohol for 8 hours.The extraction method for Radix Arnebiae can save energy and be suitable for the modern production.

Radix A rnebiae;Naphthaquinones;Orthogonal design;HPLC

R28 < class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

2010-05-26

冯文文(1983-),女,硕士生,专业方向为天然药物活性成分的研究。

王金辉(1972-),男,教授,从事天然药物化学研究;e-mail:wjh.1972@yahoo.com.cn。