利用两种电泳技术分析大麦品种的醇溶蛋白差异及亲缘关系

李守明,梁维,魏凌基,齐军仓,王金玲

(1石河子大学农学院,石河子832003;2新疆农业职业技术学院,昌吉831100)

利用两种电泳技术分析大麦品种的醇溶蛋白差异及亲缘关系

李守明1,梁维1,魏凌基1,齐军仓1,王金玲2

(1石河子大学农学院,石河子832003;2新疆农业职业技术学院,昌吉831100)

利用大麦醇溶蛋白电泳鉴定方法了解大麦各品种间的亲缘关系,采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对国内18份大麦品种的醇溶蛋白电泳图谱进行了分析。结果表明:从18个供试大麦品种中分别分离出13条和18条迁移率不同的多态性醇溶蛋白谱带。利用各品种在迁移率Rf值不同的谱带存在的明显差异,可将供试18个大麦品种区分开。对醇溶蛋白电泳结果进行聚类分析,结果显示:18份大麦材料在遗传距离(GD)0.49处聚为4个大类,这表明醇溶蛋白电泳技术对大麦品种鉴定和亲缘关系的评价是一种有效的方法。

大麦;醇溶蛋白;电泳

长期以来,品种真实性和纯度的检测仍以传统的大田小区种植为主,通过形态学标记(农艺性状)来鉴定。但此法所需周期长、成本高,而且易受环境因素和检测人员水平的影响。近年来,生物技术的发展带来了快速的品种真实性和纯度鉴定技术,如蛋白质电泳和DNA指纹等技术。由于蛋白质电泳技术具有用种量少、鉴定时间短、结果稳定、重复性高、技术简单、费用低廉等优点而被广泛用于品种鉴定[1]。蛋白质电泳鉴定技术是一种根据作物品种基因型差异进行品种真实性和纯度鉴定的快速而有效的方法。Gilliand[2]首先将蛋白质电泳技术应用于植物品种鉴定。30多年来,醇溶蛋白质电泳技术、酸溶蛋白质电泳技术、盐溶蛋白质电泳技术、酯酶同工酶电泳技术等技术先后出现,并在应用于水稻、玉米、蔬菜、杂交油菜种子的纯度鉴定试验中,均有成功的报道。

大麦是当今世界最重要的粮食、饲料及食品加工作物之一。醇溶蛋白是麦类作物种子胚乳中主要的贮藏蛋白质之一,与品种的遗传特性密切相关,其具有稳定的遗传性,一般不受种植环境的影响。因此,建立麦类作物种子醇溶蛋白的电泳图谱,就成为品种鉴定及遗传学分析的重要内容。Cooke等[3]利用ISTA标准对191个不同来源的大麦进行鉴定并将其分为41个不同群体。Stegemann等[4]利用醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)对小麦、大麦、燕麦、黑麦等数种禾谷类植物进行了品种鉴定分析。颜启传等[5]使用ISTA推荐的种子醇溶蛋白电泳方法对88个大麦不同品种进行鉴定,认为其图谱差异的大小可作为品种间亲缘关系远近的一项预测指标。林艳等[6]利用大麦种子醇溶蛋白十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PA GE)鉴定加拿大啤酒大麦的品种和纯度。本研究采用APAGE和SDS-PAGE对国内18份大麦品种的醇溶蛋白电泳图谱进行了分析,旨在说明醇溶蛋白电泳技术对大麦品种鉴定和亲缘关系的评价是一种准确、有效、快捷的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为来自我国不同省份的18个大麦品种,由石河子大学农学院作物遗传育种教研室提供。供试大麦材料的序号、名称和原产地见表1。

表1 材料的序号、名称和原产地Tab.1 Name and the origin of experimental materials

1.2 方法

1.2.1 醇溶蛋白提取

将单个大麦籽粒粉碎后置于1.5 mL离心管中,加入400μL提取液(称取0.05 g甲基紫,溶入25 mL 2-氯乙醇,蒸馏水定容至100 mL),室温下振荡30 min,4℃提取,过夜,用前高速离心(12000 r/min)10 min,取上清液进行电泳。

1.2.2 醇溶蛋白A-PAGE电泳

参照文献[7]中的A-PA GE方法,采用酸性聚丙烯酰胺凝胶 ,含 8.2%Acr、0.34%Bis、0.1% 抗坏血酸、6%尿素、0.001%硫酸亚铁、0.001%H2O2,以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸为电极缓冲液,上样12 L,再以0.4%乙酸和0.04%甘氨酸为电极缓冲液,上样,500 V恒压下挂冰盒电泳。电泳结束后,将胶小心剥出,置于染色液中染色(0.04%考马斯亮蓝、12%三氯乙酸溶液)。用10%三氯乙酸固定,过夜,考马斯亮蓝、甲醇、冰醋酸混合液染色30 min,甲醇、冰醋酸混合液脱色1 d。

1.2.3 醇溶蛋白SDS-PAGE电泳

采用不连续分离系统。堆积胶缓冲液 1.0 mol/L Tris-HCl,p H 6.8;分离胶1.0 mol/L Tris-HCl,p H 8.8;采用p H 8.3电极缓冲液。电泳结束后,将胶小心剥出并置于染色液(0.04%考马斯亮蓝、12%三氯乙酸溶液)中,染色过夜,最后用甲醇、冰醋酸混合液脱色1 d。

1.2.4 数据处理与统计分析

参照文献[8]中的方法,计算每个品种蛋白带的Rf值,相同 Rf值位置上有蛋白带记为1,无蛋白带记为0。并根据谱带颜色和带型差异将所有条带分为着色最深,带型最宽的为1a带;着色较浅,带型中等的为1b带;只有模糊的痕迹带为1c带。采用“0、1”系统记录蛋白谱带,同一 Rf值位置上有蛋白带记为1,无蛋白带记为0,建立醇溶蛋白谱带数据库。

用DPS软件,根据品种间的遗传距离值[9]以不加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 醇溶蛋白A-PAGE谱带的多态性

电泳结果(图1a)表明,18个供试大麦品种共分离出13种相对迁移率不同的醇溶蛋白谱带。供试大麦品种谱带数目不同,最少的5条,最多的11条,平均每个大麦品种分离出7.2条谱带。在13种相对迁移率不同位置上只有1条共有谱带存在,而18个大麦品种在12个等位变异位点上均存在多态性。平均每个品种分离出0.66条多态性谱带,这表明这些品种有丰富的多态性。

2.2 醇溶蛋白SDS-PAGE谱带的多态性

离出18种相对迁移率不同的醇溶蛋白谱带。供试大麦品种谱带数目不同,最少的6条,最多的16条,平均每个大麦品种分离出13.6条谱带。在18种相对迁移率不同位置上有2条共有谱带存在,在16个等位变异位点上均存在多态性。平均每个品种分离出0.66条多态性谱带,这表明这些品种具有丰富的多态性。

电泳结果(图1b)表明,18个供试大麦品种共分

图1 18个大麦品种的醇溶蛋白电泳图谱Fig.1 A-PAGE SDS-PAGE electrophoresis patterns of Hordein

2.3 醇溶蛋白A-PAGE谱带的差异

从表2可以看出,在A-PAGE所得的醇溶蛋白电泳图谱中,共出现13条带,其中相同条带只有1条,即在 Rf=0.257的条带为每个品种所共有。Rf值在0.232～0.900中的条带在18个品种间的分布有一定差异,例如 Rf=0.232的条带只有在 G23、哈密大麦、Ca23、红日啤 2号、广麦 6号、翼农 0656中出现,而其它品种在该位置上缺失。Rf=0.261的条带只有广麦2号、广麦8号缺失,而其它品种在该位置上均有带出现。Rf值在0.232～0.290的条带较为清晰,但是品种间差异不明显,Rf值在0.290～0.565的条带较少且比较模糊。Rf值在0.565～0.812的条带较多且较清晰,可以比较容易辨别条带的差异。

表2 大麦品种醇溶蛋白A-PAGE谱带的 Rf值Tab.2 Rfvalue of hordein A-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

2.4 醇溶蛋白SDS-PAGE谱带的差异

从表3可以看出,在SDS-PAGE所得的醇溶蛋白电泳图谱中,共出现18条带,其中相同条带有2条:在 Rf=0.55的条带和 Rf=0.89的条带为每个品种所共有。Rf值在0.12～0.93的条带在18个品种间的分布有一定差异。Rf=0.12的条带只有在G23缺失,而其它品种在该位置上均无该条带。Rf=0.16的条带只在新啤1号、新啤2号、昭苏6棱、甘啤3号、甘啤4号和吉啤1号中出现,其它品种在该位置上均无该条带。Rf=0.24的条带在广麦2号和广麦6号中缺失,但在其它品种中均存在该谱带。Rf=0.51的谱带在吉啤2号缺失,而其它品种均有该谱带。

表3 大麦品种醇溶蛋白SDS-PAGE谱带的 Rf值Tab.3 Rfvalue of hordein SDS-PAGE electrophoresis patterns of 18 barley cultivars

2.5 SDS-PAGE和A-PAGE电泳图谱的比较

利用SDS-PAGE和A-PAGE对18个大麦品种进行分析,均能较强地反映供试品种的醇溶蛋白多态性,分别分离出18条和13条多态性谱带,不同品种间醇溶蛋白图谱存在明显差异。在本研究中采用这两种方法无法将参试的18个大麦品种区分开(表2、表3)。由两种方法的比较结果可以看出,SDS-PAGE蛋白电泳图谱多态性较强,图谱差异性更为明显。

2.6 18个大麦品种醇溶蛋白的聚类

采用聚类分析的方法对供试材料的醇溶蛋白电泳结果进行了分析(图2)。在阀值0.49处可将供试材料分为4个大类群,8个亚类。第I类群分为2个亚类,有新啤1号、新啤2号、塔城2棱和翼农0656等4个品种;第II类群分为3个亚类,有昭苏6棱、E2、甘啤 3号、甘啤4号、94啤鉴 131和吉啤 1号等6个品种。第III类群分为3个亚类,有红日啤2号、广麦2号、广麦6号、吉啤2号和广麦8号等6个品种;第IV类群分为2个亚类,有哈密大麦、G23和Ca23等3个品种。

图2 供试材料醇溶蛋白的遗传距离聚类图Fig.2 Cluster diagram of Hordein G D of provided materials

3 讨论

目前,利用蛋白质电泳鉴定品种的方法较多,主要分为酸性和碱性两大体系。盐溶蛋白 SDSPAGE以及醇溶蛋白A-PAGE因其具有丰富的多态性已被广泛用于品种鉴定、品质分析和种质资源筛选[10-11]。超薄等电聚焦电泳和不连续醋酸尿素聚丙烯酰胺电泳也有一定的应用。目前,贮藏蛋白电泳技术在不断地改进和完善,并广泛应用于小麦、玉米、大麦、棉花、辣椒、向日葵、水稻等作物的品种鉴定。现在由于计算机技术的发展,可以利用软件系统建立大麦品种醇溶蛋白谱带库,为今后品种鉴定提供标准参考物。

对醇溶蛋白带型相同的品种,可以推测其亲缘关系较近,但由于大麦籽粒醇溶蛋白含量受到环境变异和生态条件的影响[12-13],因而不能简单地认为这些品种在所有性状上无差异或者把谱带相同的品种混为同一品种。因此,还需借助其它蛋白质电泳手段或分子遗传标记对这些品种进一步加以区分。

4 结论

1)采用SDS-PAGE和A-PA GE两种方法均可以将参试的18个大麦品种区分开,并对18个大麦品种进行分析,均能较强地反映供试品种的醇溶蛋白多态性,不同品种间醇溶蛋白图谱有明显差异。

2)SDS-PAGE蛋白电泳图谱多态性较强,图谱差异性更为明显。

3)18个大麦品种可分为4个大类。将遗传关系相近的品种聚为一类,例如新啤1号和新啤2号均由野洲2条为父本杂交选育而成。甘啤3号、甘啤4号为一个大类,其中甘啤3号是以法瓦维特为父本,而甘啤4号是以法瓦维特为母本杂交育成的,因而具有较近的亲缘关系。

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[6]林艳,梅承芳,董建军,等.利用蛋白质“指纹”技术鉴定加拿大啤酒大麦的品种和纯度[J].食品与发酵工业,2005,31(6):97-100.

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Difference and Relation between Two Hordein of
Barley Cultivars by Electrophoresis

LI Shouming,LIANG Wei,WEI Lingji,QI Juncang,WANGJinling
(1 College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Xinjiang Agricultural Vocational Technical College,Changji 831100,China)

In order to investigate the difference and relation of two hordein of different barley cultivars by electrophoresis,18 barley cultivars was analyzed by acidicpoly acrylamide gel electrophoresis and sodium dodecyl sulfate-olyacrylamide gel electrophoresis.The results showed that a total 13 and 18 hordein bands with relatively different migration rates was identified in these materials.The findings suggested that the hordein patterns in different barley cultivars differed greatly.Hordein bands with differentRfvalues were so obviously different that the 18 barley cultivars could be easily distinguished.Cluster analysis showed that the 18 barley cultivars could be classified into 4 groups at the level of genetic distance 0.49.The conclusion is that hordein electrophoresis is a feasible method for barley cultivars identification and relation evaluation.

barley;hordein;electrophoresis

S635.1 < class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

2009-11-16

农业部948项目(2006-G9-6)

李守明(1977-),男,农艺师,硕士生,专业方向为生物技术在遗传育种;e-mail:lishouming@stu.shzu.edu.cn。

魏凌基(1955-),女,教授,从事生物技术在遗传育种中的应用研究;e-mail:wlj_agr@shzu.edu.cn。