高效液相色谱——串联谱法测定樱桃番茄中四种季铵类农药

张 曦，金 芬，*，钱永忠，*，于志勇，王 静

(1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农产品质量与食物安全重点实验室，北京100081;2.中国科学院生态环境研究中心，国家水质学重点实验室，北京100085)

高效液相色谱
——串联谱法测定樱桃番茄中四种季铵类农药

张 曦1，金 芬1，*，钱永忠1，*，于志勇2，王 静1

(1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农产品质量与食物安全重点实验室，北京100081;2.中国科学院生态环境研究中心，国家水质学重点实验室，北京100085)

建立了4种季铵类农药(矮壮素、燕麦枯、敌草快和缩节胺)的高效液相色谱－串联质谱(LC－MS/MS)检测方法。样品用75%乙腈－水溶液提取，高速离心后取上清液过尼龙滤膜，用亲水柱分离，以含0.1%甲酸的水∶乙腈=25∶75(V∶V)作为流动相，在正离子多反应监测(MRM)模式下进行测定。4种季铵类农药的线性范围为0.5～100ng/mL，线性相关系数在0.9982～0.9996范围内，方法检出限为0.005mg/kg，可以满足国际限量的要求。在0.04、0.08、0.16mg/kg添加浓度下，4种季铵类农药的回收率为91.4%～106.3%，相对标准偏差(RSD)小于15%。本方法可用于樱桃番茄样品中4种季铵类农药的测定。

季铵化合物，农药，液相色谱－串联质谱法，樱桃番茄

季铵类化合物作为除草剂和植物生长调节剂在农业上有着广泛的应用，常见的季铵类农药包括燕麦枯(Difenzoquat，DF)、敌草快(Diquat，DQ)、矮壮素(Chlormequat，CQ)和缩节胺(Mepiquat，MQ)等(结构见图1)。敌草快对生物体的氧化还原活性影响很大，如肺、心、肝、肾等均有不同程度的伤害，世界卫生组织将敌草快和燕麦枯归为中等毒性［1］。近年来有研究表明矮壮素可能对动物的繁殖能力有影响，因此被列为疑似内分泌干扰物［2－3］。为此，许多国家对该类农药都有严格的检验要求和规定，如欧盟规定番茄中敌草快和矮壮素为0.05mg/kg［4］，而日本规定矮壮素和燕麦枯为0.05mg/kg，缩节胺则为一律标准0.01mg/kg［5］。由于季铵类农药在低pH条件下完全电离，以阳离子形式存在，普通的C18柱对其无法保留，所以对季铵类农药残留分析的报道较少。已报道的研究有马铃薯中的敌草快［6］，水中的敌草快和百草枯［7－9］，番茄及番茄酱中的矮壮素和缩节胺［10］，粮谷中的矮壮素［11］以及土壤中的矮壮素［12－13］的测定等。目前，主要采用基于不同色谱分离机理(如C18柱、苯基柱及离子交换柱)的液相色谱－质谱法测定季铵类农药。虽然目前离子对色谱法是众多国家推荐的标准方法，但由于其在流动相中添加离子对试剂会对质谱系统造成污染，抑制负离子模式下的信号［14－15］，所以该方法不适用于检测矮壮素、缩节胺等物质。目前，利用亲水色谱柱分析食品中季铵类农药的种类还很少，还没有能够同时测定敌草快、燕麦枯、矮壮素及缩节胺4种季铵类农药的液相色谱－质谱法。为此，本研究建立了采用亲水柱的液相色谱－串联质谱法测定樱桃番茄中4种季铵类农药的分析方法。

表1 四种季铵类农药的质谱条件参数

图1 四种季铵类农药的结构

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

矮 壮 素 (ChlormequatChloride，CQ，99% ±0.5%)、敌草快(diquat dibromide hydrate，DQ，98%)、燕麦枯(difenzoquat methyl sulfate，DF，99%)、缩节胺(Mepiquat Chloride，MQ，99% ±0.5%) 4 种标准品购自德国Labor Dr.Ehrenstorfer－Schafers公司;甲醇、乙腈 色谱纯，德国Merck;甲酸 96%，美国DIMA公司;超纯水;其余试剂 均为分析纯。

高效液相色谱仪 Aglient 1200，美国安捷伦公司;质谱 API2000，美国 AB公司;高速分散机

T18，德国IKA;离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;超纯水机 Millipore，美国Millipore公司;尼龙滤膜(0.2μm)。

1.2 样品预处理

选取一定数量有代表性的样品，切碎，于榨汁机中捣碎，均匀分散，称取捣碎试样5g(准确至0.01g)于50mL聚丙烯离心管中，加入适量的超纯水，使得试样中的水与超纯水的总量为10mL，加入30mL乙腈。在高速匀浆机上匀浆2min，将高速匀浆后的样品于9000r/min下离心5min。吸取1～2mL上述离心液上清液，过0.2μm尼龙滤膜。将滤液收集于1.8mL样品瓶内，用于测定。

1.3 色谱条件

色谱柱:Atlantis HILIC Silica，150mm ×2.1mm(i.d.)，粒径 3μm;柱温:40℃;进样体积:10μL;流动相:含 0.1% 甲酸的水∶乙腈 =25∶75(V∶V)，流速:0.2mL/min。

1.4 质谱条件

离子源(Ion Source):电喷雾离子源(Turbo IonSpray，TIS)，正离子扫描方式;离子源温度(Temperature，TEM):500℃;气帘气压力(Curtaingas，CUR):30V;离子喷雾电压(IonSpray Voltage):5500V;雾化气压力(Gas1):50psi;加热辅助气压力(Gas2):55psi;碰撞气压力(Collisiongas):4V;驻留时间:200ms。矮壮素和缩节胺质谱条件参数见表1。

2 结果与分析

2.1 质谱参数的确定

矮壮素(CQ)、缩节胺(MQ)和燕麦枯(DF)进入一级质谱后，很容易产生稳定的［M］+，m/z分别为112、114、249。［M］+离子作为母离子进入二级质谱后发生断裂或重排等反应产生不同碎片离子，CQ产生有显著丰度的m/z 58.1及63.1离子碎片，MQ产生m/z 58.1和98.2的离子碎片，DF产生m/z 118.0及193.1离子碎片。CQ、MQ和DF的定量离子分别选择丰度较高的m/z 63.1，58.1和118.0碎片离子，这与现有的文献报道相一致［16－18］。而DQ进入质谱后产生较稳定的［M－H］+，［M－H］+离子作为母离子产生碎片离子 m/z 157和78。其中 m/z 157为［M－C2H3］+丰度最高，作为定量离子。

碰撞能量(Collision Energy，CE)是影响碎片离子分布的最重要因素之一，如果CE能量过高，会产生很多小的碎片，造成碎片信息过多过杂，有时对于某些化合物，很高的CE会产生很差的质谱图;而CE能量过低，会造成结构信息不足等。在多离子监测(MRM)模式下，可以针对每一对离子进行优化。如图2所示，CQ、MQ和DF在较低的CE值(29～42V)下，每个子离子即可达到最高响应。但对于DQ来说，在 CE 为57V 的条件下，m/z 78［M－C2H3］2+的响应比m/z 157［M－CH4］+高3倍，所以在 DQ定量离子选择157>78。

2.2 色谱条件的优化

与甲醇相比，乙腈作为流动相能获得较低的柱压和较高的响应值，故本实验选择乙腈作为流动相的有机相。为了获得较高的灵敏度和分离效果，本实验比较了不同流动相配比对4种季铵类农药的分离与灵敏度的影响。如图3所示，乙腈的比例越高，4种季铵类农药在柱上的保留越强，但峰宽也越大，这就给样品的定量带来困难。此外，乙腈比例为75%时灵敏度最高。因此，综合考虑灵敏度与分析速度，本实验选择了乙腈和水相比例为75∶25，作为定量分析的色谱条件。

图2 不同CE值条件下四种季铵类农药碎片的离子强度注:a－MQ;b－CQ;c－DQ;d－DF。

2.3 提取条件的优化

2.3.1 提取液的优化 季铵类化合物的强极性结构决定了其易溶于水的性质，因此选择75%乙腈－水溶液，67%乙腈－水溶液和100%水溶液，分别对加标果蔬样品中4种季铵类农药进行了提取。在该三种提取液中，4种季铵类农药的回收率均能满足要求，其中100%水溶液为75%～79%，75%乙腈－水溶液为83%～84%，67%乙腈－水溶液为71%～77%(图4)。考虑到75%乙腈－水溶液的提取液与液相条件中的流动相配比相同，而其他两种提取液如果在直接进样后会由于溶剂效应的影响而造成峰拖尾或变宽，所以必须在进行前重新用流动相转溶，这就增大了结果的误差且降低了方法的灵敏度，因此，本实验选择75%乙腈－水溶液作为提取液。

2.3.2 提取液用量的确定 不同提取液用量对季铵类农药的回收率也有较大影响，本研究比较了20、40、50mL三个不同体积提取液用量对回收率的影响(表2)。由于樱桃番茄本身含水量较高，当提取液体积为20mL时，达不到有机相和水相比例为3/1;而当提取液体积为50mL时，樱桃番茄样品和提取液几乎充满整个离心管，在离心过程中溶液容易从离心管中漏出，污染离心机且影响回收率的结果。综合考虑操作的可行性与回收率效果的影响，本方法确定40mL为提取液的体积。

图3 不同流动相配比条件下四种季铵类农药的灵敏度和分离效果

图4 不同组成提取液的提取效果

2.4 线性范围、检出限、回收率和精密度

用基质加标样品 0.5、1、5、10、20、50、100ng/mL作为工作溶液绘制标准曲线。在上述色谱－质谱条件下，得到4种季铵类农药的浓度与峰面积的线性关系，相关系数见表3。

在樱桃番茄样品中添加浓度分别为0.04、0.08、0.16mg/kg的四种季铵类农药的回收率为91.7%～106.3%，相对偏差在1.5%～12.5%范围内，具体数据见表4。以10倍信噪比计算求得4种季铵类农药的仪器检出限分别为0.05～0.2μg/kg;而方法检出限为0.005mg/kg，能够满足目前国际限量的要求。

2.5 实际样品的测定

利用上述所建立的分析方法，对北京市水果批发市场及超市中50个批次的樱桃番茄样品进行了分析，结果表明，其中34个批次的樱桃番茄中含有矮壮素，浓度范围在0.01～9.4mg/kg，6个批次的样品中含有缩节胺，浓度范围在0.01～0.38mg/kg，而只有1个批次的样品中检出DQ和DF，分别为0.01和0.04mg/kg。

表2 不同提取液体积的提取效果

表3 四种季铵类农药的线性关系、相关系数和检出限

表4 樱桃番茄中4种季铵类农药的加标回收率(%)及相对标准偏差(RSD)

3 结论

本研究采用亲水色谱柱，避免了离子对试剂的使用，克服了由于离子对试剂污染质谱负离子模式的缺点，建立了同时测定樱桃番茄中敌草快、燕麦枯、矮壮素和缩节铵四种季铵类农药的高效液相色谱－串联质谱检测方法。该方法灵敏度高，能够满足国际限量的要求。

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Simultaneous determination of quaternary ammonium compounds in tomato by liquid chromatography－tandem mass spectrometry

ZHANG Xi1，JIN Fen1，*，QIAN Yong－zhong1，*，YU Zhi－yong2，WANG Jing1
(1.Key Lab of Agro－product Quality and Safety，Institute of Quality Standards ＆ Testing Technology for Agro－products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China;2.State Key Lab of Environmental Aquatic Chemistry，
Research Center for Eco－Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085，China)

A method for the simultaneously determination of four representative quaternary ammonium compounds［chlormequat(CQ)chloride，mepiquat(MQ)chloride，deiquat(DQ)dibromide hydrate and difenzoquat(DF)methyl sulfate］，using liquid chromatography－tandem mass spectrometry(LC－MS/MS)system was developed.The chromatographic separation was performed using a hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC)column to avoid LC－MS system contamination with the use of ion－pair reagents.Aqueous solution containing 0.1%formic acid(A)and acetonitrile(B)(75 ∶25，V/V)were used as the mobile phasegavegood chromatographic retention and sensitivity for these four quaternary ammonium compounds(QACs).The recovery was 91.4%～106.3%for the four QACs at three concentration levels.The limit of quantitation(LOQ)for the four QACs in tomato samples were 0.005mg/kg based on the lowest spiked concentration with suitable precision and accuracy.Finally，the method was successfully used to detect residual QACs in cherry－tomatoes.

quaternary ammonium compounds;pesticides;LC－MS/MS;cherry－tomatoes

TS207.5+3

A

1002－0306(2011)06－0394－04

2010－04－14 *通讯联系人

张曦(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:食品安全与检测技术。

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(0032007228);2008年农业行业标准制修订项目资助。