均匀设计法在鸡血红素吸时提取中的应用

区子弁，王 琴，何淑仪

(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225)

均匀设计法在鸡血红素吸时提取中的应用

区子弁，王 琴*，何淑仪

(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225)

目的:借助均匀设计，确立鸡血红素吸附提取的最优工艺。方法:以新鲜抗凝鸡血为原料，经超声波溶血后，比较了pH、吸附时间、吸附剂添加量、吸附剂种类对鸡血中血红素提取的影响。结果:以血红素得率为指标，实验的最优条件为pH为5.2，吸附剂添加量2.4%(w/v)，吸附时间8h，选用CMC作吸附剂时，血红素得率可达最大值2.848%(w/v);以血红素纯度为指标，实验的最优条件为pH为4.8，吸附剂添加量3.1%(w/v)，吸附时间5h，选用CMC作吸附剂时，血红素纯度可达最大值3.04%(w/v)。

鸡血红素，均匀设计，吸附提取

血红素为一种含铁的卟啉类化合物，作为血红蛋白的辅基，大量存在于人和哺乳动物血液的红细胞中，起着运输氧的重要功能。20世纪80年代初，人们开始应用血红素治疗缺铁性贫血，收到比传统铁制剂诸如硫酸亚铁、富马酸铁、葡萄糖酸亚铁等更显著的疗效［1］。同时开始对牲畜血中提取血红素的方法进行多方面的改进［2－3］。血红素作为预防和治疗缺铁性贫血的有效制剂，探索一种经济、简便而高效的提取制备方法，一直被相关专业工作者所重视［4－5］。考虑到一些增稠剂具有独特的吸附作用，且在吸附血红素的同时其自身亦能作为食品的赋形剂，本文采用吸附法提取鸡血红素，并借助均匀设计优化提取工艺，以求为鸡血的深加工提供一种方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡血 购自广州市远安路市场;血红素标准品南京奥多福尼生物科技有限公司，纯度≥98%;其他常规试剂 均为分析纯。

TU－1810PC紫外－可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;PHS－3C精密pH计 上海精密仪器仪表有限公司;TDL－5－A离心机 上海安亭科学仪器厂;DZF－250真空干燥机 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血红素制备 新鲜鸡血加8g/L柠檬酸钠做抗凝剂，搅拌均匀，3600r/min离心15min，倾出上清液，收集红细胞，再用9g/L的生理盐水洗涤红细胞2次，离心取浓缩红细胞。将干净的红细胞加入一定量的去离子水和乙醇，超声波处理溶血后，过滤，沉淀部分用酸搅拌抽提，抽滤，滤液用NaOH溶液调pH至析出沉淀，加入吸附剂，静置抽提，3600r/min离心，取沉淀，用等体积去离子水和无水乙醚分别洗涤2次，离心，真空干燥得粗品血红素。

1.2.2 血红素含量测定

1.2.2.1 血红素最大吸收波长的测定 精确称取血红素标准品0.0200g，置于50mL烧杯中，用0.1mol·L－1NaOH溶解后转移至100mL容量瓶中，另用同浓度的NaOH溶液分3次洗涤烧杯，洗涤液合并至容量瓶并稀释至刻度，即成血红素标准贮备液。精密量取血红素标准贮备液2.0mL，置于10mL比色管中，用0.1mol·L－1NaOH定容，摇匀，即成血红素标准供试液。设定紫外－可见分光光度计的波长范围为300～540nm，扫描间距0.5nm。以0.1mol·L－1NaOH 溶液为空白，校正基线后向同一比色皿加入血红素标准供试液，测定血红素的最大吸收波长［6］。本标准品经测定其最大吸收波长为396nm。

1.2.2.2 标准曲线的绘制 血红素标准贮备液的制备如1.2.2.1所述。然后精密量取血红素标准贮备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别置于 6 个 10mL 比色管中，用0.1mol·L－1NaOH 定容，摇匀，即成血红素标准系列供试液。以0.1mol·L－1NaOH溶液为空白，在最大吸收波长下测定各自的吸光度。得回归方程 y=0.01328x－0.00961，R2=0.9991。

1.2.2.3 血红素样品浓度的测定 精确称取血红素样品约1g，置于50mL烧杯中，用0.1mol·L－1NaOH溶解后转移至100mL容量瓶中，另用同浓度的NaOH溶液分3次洗涤烧杯，洗涤液合并至容量瓶并稀释至刻度，即成血红素样品贮备液。精密量取血红素样品贮备液2.0mL，置于10mL比色管中，用0.1mol·L－1NaOH定容，摇匀，离心后取上层清液测定吸光度(以0.1mol·L－1NaOH 溶液做空白)。

1.2.2.4 血红素提取工艺的均匀实验设计 根据血红素提取工艺的影响因素与水平，将按照U6(63×3)混合水平均匀设计表安排实验，如表1所示。

表1 血红素提取工艺的均匀设计实验安排［U6(63×3)］

1.2.2.5 检测指标 考虑到最终产物血红素的得率和纯度均较为重要，故实验的检测指标有两个——血红素得率和血红素纯度，其计算公式分别如下所示。在称量吸附剂质量变化前应把沉淀物用等体积的无水乙醚、去离子水分别洗2次，离心后待无水乙醚完全挥发，再置于真空干燥箱内烘干。

血红素得率(%)=Δ(吸附剂吸附前后质量变化)/样品提取液初始体积×100%

2 结果与分析

2.1 血红素提取工艺的均匀设计实验结果

按照表1的安排，所得实验结果如表2所示。

表2 均匀设计实验结果

2.2 均匀设计实验结果分析

2.2.1 以血红素得率为指标 采用DPS数据处理系统软件中的多因子及互作项逐步回归分析，结果如表3所示。得出回归模型优化表达式:y=－8.44617351+1.9005105425x1+7.391266004x2－1.2809120271x1x2－0.11691808024x2x4

此回归方程相关系数R=0.999972，调整后的相关系数 Ra=0.999862，总体显著性检验值 F=4531.9904，显著水平达到p=0.0095，剩余标准差SSE=0.0142，因此该方程的可信度较高。同时根据方程对血红素得率进行预测，当x1(pH)为5.2，x2(吸附剂添加量)=2.4%，x3(吸附时间)=8h，x4(吸附剂种类)为CMC时，得到y(血红素得率)最大预测值为2.91%。

表3 均匀设计逐步回归分析结果(以血红素得率为指标)

根据回归分析所得出的上述4个因素的最优值重新组合并进行优化实验，结果如表4所示。

表4 优化实验结果(以血红素得率为指标)

由表4优化实验结果可知，实测平均值为2.848%，与模型预测值2.91%相差不大。通过t检验分析可知，t=－0.421 ＜t0.05(4)=2.776，p=0.695，因此，可知实测平均值与模型预测值没有显著差异，这进一步说明回归方程可信度较高。

因此，当以血红素得率为指标，实验的最优条件为pH为5.2，吸附剂添加量2.4%(w/v)，吸附时间8h，选用CMC作吸附剂时，血红素得率可达最大值2.848%(w/v)。

2.2.2 以血红素纯度为指标 采用DPS数据处理系统软件中的多因子及互作项逐步回归分析，结果如表5所示。

表5 均匀设计逐步回归分析结果(以血红素纯度为指标)

得出回归模型优化表达式:y=2.328358804+1.5881594684x2－0.25747698149x1x2+0.018732162632x2x3－0.05806423034x3x4

此回归方程相关系数R=0.999994，调整后的相关系数 Ra=0.999972，总体显著性检验值 F=22479.8477，显著水平达到 p=0.0050，剩余标准差SSE=0.0039，因此该方程的可信度较高。同时根据方程对血红素得率进行预测，当x1(pH)为4.8，x2(吸附剂添加量)=3.1%，x3(吸附时间)=5h，x4(吸附剂种类)为CMC时，得到y(血红素纯度)的最大预测值为3.13%。

根据回归分析所得出的上述4个因素的最优值重新组合并进行优化实验，结果如表6所示。

表6 优化实验结果(以血红素得率为指标)

由表6优化实验结果可知，实测平均值为3.04%，与模型预测值3.13%很接近。通过t检验分析可知，t=－1.083 ＜t0.05(4)=2.776，p=0.340，因此，可知实测平均值与模型预测值没有显著差异，这进一步说明回归方程可信度较高。

因此，当以血红素纯度为指标，实验的最优条件:pH为4.8，吸附剂添加量3.1%(w/v)，吸附时间5h，选用CMC作吸附剂时，血红素纯度可达最大值3.04%(w/v)。

3 结论

确定用CMC－Na完成提取工艺阶段的氯化血红素提取。最佳工艺参数为:以血红素得率为指标，实验的最优条件为pH为5.2，吸附剂添加量2.4%，吸附时间8h;以血红素纯度为指标，实验的最优条件为pH为4.8，吸附剂添加量3.1%，吸附时间5h。整个工艺过程成本低廉，且通过均匀设计准确找出鸡血红素提取的最优工艺，这最终为鸡血的综合深加工开辟一条可行之路。

［1］Autio K，Mietsch F.Heat induced gelation of myofibrillar proteins and sausages:Effect of blood plasma and globin［J］.Journal Food Science，1990，55:1494－1496.

［2］刘任民，范万东，王摇风，等.猪血中高纯度血红素的提取工艺［J］.现代医药卫生，2007，23(18):2687－2689.

［3］李晨光，庄红，吕学举，等.动物血液血红素铁提取方法研究［J］.食品工业科技，2008(1):308－310.

［4］李秀玲，余蓉，杨继虞，等.高纯度血红素制备工艺的改进［J］.四川大学学报:医学版，2004，35(5):738－744.

［5］P K Mandal，V K Rao，B N Kowale，et al.Utilization of Slaughter House Blood in Human Food［J］.Journal Food Science，1999，36(2):91－105.

［6］王光亚.保健食品功效成分检测方法［M］.北京:中国轻工业出版社，2002:129－131.

Application of uniform design on adsorbing extraction of chicken hemin

OU Zi－bian，WANG Qin*，HE Shu－yi
(College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China)

Objective:The optimal process of adsorbing extraction of chicken hemin was determined by uniform design.Methods:The fresh chicken blood added sodium citrate was used for extracting of heme.The parameters of extraction by pH，adsorbing time，types and additions of sorbent were compared.Results:Index by yield and purity of hemin，the optimal conditions were pH5.2 and 4.8，addition of sorbent were 2.4%and 3.1%，time of sorbent were 8h and 5h，respectively，and both of the type of sorbent was CMC.The yield of hemin was up to 2.848%(w/v)and the purity was 3.04%(w/v).

chicken hemin;uniform design;adsorbing extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)06－0304－03

2010－06－18 *通讯联系人

区子弁(1985－)，男，在读研究生，主要从事天然产物的研究与开发。

校创新基金项目(H1409008)。