低温果胶酶的纯化及酶的化及酶学性质的研究

王 伟，李 锋，张 磊，茆 军

(1.新疆农业大学食品科学学院，新疆乌鲁木齐830052;2.新疆农业大学化工学院，新疆乌鲁木齐830052;3.新疆农业大学教务处，新疆乌鲁木齐830052;4.新疆农业科学院微生物研究所，新疆乌鲁木齐830091)

低温果胶酶的纯化及酶的化及酶学性质的研究

王 伟1，李 锋2，张 磊3，茆 军4

(1.新疆农业大学食品科学学院，新疆乌鲁木齐830052;2.新疆农业大学化工学院，新疆乌鲁木齐830052;3.新疆农业大学教务处，新疆乌鲁木齐830052;4.新疆农业科学院微生物研究所，新疆乌鲁木齐830091)

进行了低温果胶酶产生菌的筛选，并对低温果胶酶的酶学性质、纯化及动力学常数进行了研究。结果表明:该酶最适酶反应温度25℃，最适酶反应pH为5.8;酶液的pH稳定范围在5～6.4;在25℃保温3h，酶活降至50.5%，在35℃保温2h，酶活降至55.1%，在45℃保温1.5h，酶活降至48.7%，在55℃保温1h，酶活降至43.1%;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用，而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用;当以果胶为底物时，该酶的动力学常数Km为27.86mg/mL，Vmax为152.13μmol/(min·mL);采用不同的处理方法均可使低温果胶酶得到纯化，但40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好。

低温果胶酶，最适酶反应温度，最适酶反应pH，分离纯化

果胶，化学名聚半乳糖醛酸，主要是由D－半乳糖醛酸以α－1，4糖苷键连接形成的直链状聚合物，是植物体中一类复杂的胶体性多糖类，是植物细胞壁的组成成分，填充在植物的细胞壁之间，具有使细胞粘合在一起的作用［1］。果胶经果胶酶分解后，植物细胞便分离。果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称，果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶［2－4］。果胶酶主要运用于果汁提取、果汁澄清、果酒澄清与过滤、果实脱皮、纺织工业麻类脱胶、畜牧业的饲料添加剂及中药营养液的深加工等。面对当今世界社会发展的重大问题(如粮食短缺、资源枯竭、生态环境恶化)，本实验开展了低温果胶酶的研究，旨在利于节约能源，保护环境，并在降低生产成本等方面发挥积极作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 由实验室从采集的土样中分离得到;富集培养基 牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，橘皮粉2%，pH7;初筛平板培养基果胶0.1%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，琼脂2%，pH7;基础发酵培养基 橘皮粉2%，硫酸铵0.2%，酵母膏0.5%，K2HPO40.2%，MgSO40.2%，NaCl0.1%，MnSO40.00025%，FeSO40.00075%，pH7;种子培养基 麦芽膏0.3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，葡萄糖1.0%，pH6.5。

541 7R型高速冷冻离心机，FA2104型电子天平，LDZX－40BI型高压灭菌锅，GKC型数显控温水浴锅，THZ－82恒温振荡器，SW－CJ－IC型超净工作台，DHG－9140A型恒温培养箱。

1.2 实验方法

1.2.1 技术路线 采样→富集培养→初筛→复筛→酶学特性研究

1.2.1.1 初筛 将富集培养液稀释涂布于初筛平板上，25℃培养6d左右，加1%(W/V)的十六烷基三甲基溴化铵，静置，菌落周围出现透明圈的为产果胶酶的菌株。

1.2.1.2 复筛 将初筛后得到的菌株接入液体种子培养基，摇瓶培养15h后接种于液体发酵培养基上，在温度为25℃，150r/min恒温振荡器培养96h，取粗酶液测定果胶酶活性。

1.2.1.3 酶活力的测定 依据文献［5］，以Sigma公司的桔子果胶为底物，用次亚碘酸法定量测定，所生成的半乳糖醛酸量表示果胶酶的活力。酶活力的定义为:在pH5.8，25℃下，1h酶促化果胶分解生成1mg游离半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活性单位。

1.2.2 低温果胶酶酶学性质研究

1.2.2.1 低温果胶酶最适酶反应温度的测定 在pH为3.5的条件下，取不同温度，分别测定粗酶液的酶活力，确定最适酶反应温度。

1.2.2.2 低温果胶酶的温度稳定性 将酶液在不同温度下分别放置30min，在pH为3.5，温度为25℃的条件下，测定残余酶活力，确定酶活稳定温度范围。

1.2.2.3 低温果胶酶热稳定性 将酶液分别置于不同温度下，每隔30min测定残余酶活力，确定酶热稳定性曲线。

1.2.2.4 低温果胶酶的最适酶反应pH 分别配制不同pH的缓冲液，在25℃条件下，分别测定粗酶液的酶活力，确定最适酶反应pH。

1.2.2.5 低温果胶酶的稳定pH范围测定 用不同pH的缓冲液与粗酶液分别按4∶1体积混合，4℃保存12h。分别测定酶活力，确定最适酶反应pH范围。

1.2.2.6 金属离子对低温果胶酶酶活力的影响 将不同金属盐用pH为5.8的柠檬酸－柠檬酸纳缓冲液溶解，配制成物质量浓度为2mmol/L的含金属盐的缓冲液，在25℃分别测定粗酶液的活力。

1.2.2.7 低温果胶酶的动力学常数的测定［6］采用Lineweave－Burk双倒数法作图，求得Km与Vmax。

1.2.3 低温果胶酶粗酶液的纯化 将粗酶液分别采用硫酸铵一次沉淀法、SephadexG2－100凝胶过滤法和DEAE52－cellulose离子交换层析法进行分离纯化，并分别测定酶液中蛋白质的含量和酶活力。

2 结果与分析

2.1 果胶酶产生菌的筛选

表1 低温果胶酶产生菌筛选结果

从采集的土样中经过富集培养、初筛，挑选在筛选平板上生长速度快并产生明显透明圈，且H/C(H为透明圈直径，C为菌落直径)大的菌株摇瓶发酵进行复筛。最后得到6株产酶特性较佳的菌株，其中一株生长较快，经反复培养产酶特性稳定，菌种定名为LP272，并以其为研究菌株进行果胶酶酶学特性的初步研究。

2.2 菌株LP272的生化鉴定

菌株LP272经生化鉴定仪鉴定后，结果如表2。

表2 菌株LP272生化鉴定结果

通过VITEK32自动鉴定仪测定，其结果为指甲隐球酵母(Cryptococcus nuiguttulatus)。

2.3 低温果胶酶酶学性质研究

2.3.1 低温果胶酶最适酶反应温度的测定 结果如图1。

图1 最适酶反应温度曲线

由图1可知，菌株LP272所分泌的低温果胶酶的最适酶反应温度为25℃，且为低温果胶酶。该酶在不同温度下进行反应时，呈现出较为典型的钟形曲线。

2.3.2 低温果胶酶的温度稳定性 结果如图2。

由图2可知，菌株LP272所分泌的低温果胶酶在25℃以下保存时，酶活性变化不大。在30℃的条件下保存30min，酶活力仍然保留了95.2%，即使当温度达到50℃时，酶活性还保留了65%，这一现象说明菌株LP272所分泌的低温果胶酶对常温有一定的抵抗能力。

2.3.3 低温果胶酶的热稳定性 结果如图3。

图2 酶的温度稳定性曲线

图3 酶的热稳定性曲线

由图3可知，菌株LP272所分泌的低温果胶酶，在25℃保温3h，酶活力降低至50.5%;35℃保温2h，酶活力降低至50.1%;45℃保温1.5h，酶活力降低至48.7%;55℃保温1h，酶活力降低至43.1%。

2.3.4 低温果胶酶最适酶反应pH的确定 结果如图4。

图4 最适酶反应pH曲线

由图4可知，菌株LP272所分泌的低温果胶酶在酶反应pH为5.8时酶活力最高。当pH小于5.8时，随着缓冲液酸性的减弱，酶活力逐渐变大;但当pH大于5.8时，酶活力显著减小，当缓冲液显碱性时，酶活力继续下降。2.3.5 低温果胶酶的稳定 pH范围测定 结果如图5。

图5 酶的稳定pH范围曲线

由图5可知，菌株LP272所分泌的低温果胶酶pH稳定范围在pH5～6.4，当pH达到7.0时，酶活力保留了55.7%，pH达到8.0时，酶活力只保留了25.1%，说明碱性环境不利于低温果胶酶的保存。

2.3.6 金属离子对低温果胶酶酶活力的影响 结果如图6。

图6 金属离子对酶活力的影响

由图 6可知，Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用，其作用大小的顺序为Ca2+> Mg2+>Zn2+>Mn2+>Fe2+>Na+，而 Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用，其作用大小的顺序为Hg2+>Pb2+>Cu2+>Fe3+>Ba2+。

2.3.7 低温果胶酶的动力学常数 将果胶分别配制成浓度为5、10、15、20、30mg/mL，在25℃、pH5.8的条件下，测定酶活力，利用Lineweave－Burk双倒数法作图求出低温果胶酶的动力学常数，结果如图7。

图7 以果胶为底物的Lineweave－Burk图

利用公式:1/V=1/Vmax+(Km/Vmax)·(1/［S］)，求出低温果胶酶的动力学常数，当以果胶为底物时，Km为27.86mg/mL，Vmax为152.13μmol/(min·mL)。2.3.8 低温果胶酶的分离纯化 结果如表3。

表3 分离纯化结果

由表3可知，采用不同的处理方法均使低温果胶酶得到纯化。但综合纯化倍数、比活力及回收率三项指标，40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好，纯化倍数为2.449倍，比活力为691.86U/mg，回收率为86.97%。

3 结论

从采集的土样中筛选到一株产低温果胶酶的菌株LP272，经鉴定该菌属于指甲隐球酵母。其产生的低温果胶酶最适酶反应温度为25℃，最适酶反应pH为pH5.8;粗酶液在25℃保温3h，酶活降至50.5%，在35℃保温2h，酶活降至50.1%，在45℃保温1.5h，酶活降至48.7%，在55℃保温1h，酶活降至43.1%;该酶的pH稳定范围在pH5～6.4;金属离子 Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用，而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用;当以果胶为底物时，该酶的动力学常数Km为27.86mg/mL，Vmax为152.13μmol/(min·mL);采用不同的处理方法均使低温果胶酶得到纯化，但40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好。

［1］郭爱莲，张红莲，冯琛.某些物质对细菌Xg－02果胶酶活性的影响［J］.西北轻工业学院学报，2001，19(1):18－21.

［2］张树政.酶制剂工业(下)［M］.北京:科学出版社，1984:625－634.

［3］江洁，刘晓兰，等.果胶酶活性分光光度测定方法的研究［J］.齐齐哈尔大学学报，1998，14(1):63－66.

［4］Alkorta L，Garbisu G，Llama MJ，et al.Industrial application of pectic enzymes:a review［J］.Process Biochem，1998，33:21－28.

［5］郭爱莲，王少辉，刘忠.产果胶酶芽孢杆菌Xg－01的分离、筛选及发酵条件的研究［J］.西北大学学报:自然科学版，1997(2):53－56.

［6］Ullah A H J.Prep Biochem［J］，1998，18:443－458.

Study on purification and characteristics of the cold adapted pectinase

WANG Wei1，LI Feng2，ZHANG Lei3，MAO Jun4
(1.College of Food Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;2.College of Chemical Engineering，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;3.Academic Affairs Office，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;4.Institute of Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Science，Urumqi 830091，China)

The strain producing cold adapted pectinase was screened，and the characteristics of cold adapted pectinase，purification and kinetic constant were studied.The results showed that:the optimal temperature and pH for the enzyme reaction was 25℃ and 5.8，the enzyme was stable at pH5～6.4，after 3h at 25℃，the enzyme activity was 50.5%，at 35℃for 2h，the enzyme activity was 55.1%，at 45℃ for 1.5h，the enzyme activity was 48.7%，at 55℃ for 1h，the enzyme activity was 43.1%.The metal ion Mg2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Fe2+，Na+enhanced the cold adapted pectinase activity，but the metal ion Ba2+，Hg2+，Cu2+，Fe3+，Pb2+inhibited the cold adapted pectinase activity strongly.The kinetic constant of the cold adapted pectinase was Km value 27.86mg/mL and Vmax 152.13μmol/(min·mL)when pectin(sigma)as a substrate.The cold adapted pectinase was purified by ammonium sulfate salted out and the optimal range of ammonium sulfate saturation was 40%～85%.

cold adapted pectinase;the optimal temperature for the enzyme reaction;the optimal pH for the enzyme reaction;purification

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)04－0162－04

2009－10－10

王伟(1978－)，男，讲师，研究方向:微生物发酵工程。