微波预处理－溶剂回流提取白芷香豆素类成分的工艺研究

张小维，董自亮，肖丹

点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 610075

白芷为一种常用中药，中国药典2005年版收载的白芷为伞形科植物白芷 Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f或杭白芷 Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f．var．formosana(Boiss．)shan et Yuan的干燥根，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的作用，临床广泛应用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带和疮疡肿痛等症，并有较好的疗效［1］。白芷中香豆素类为其镇痛的主要成分，又以欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素为其主要成分，其止痛效果已被充分肯定［2］。白芷中香豆素含量的高低，是中药白芷品质评价的重要指标之一。

微波预处理过程中微波作用的是刚好被汽化剂湿润的物料，微波几乎全被物料吸收，处理时间只有几十秒，由于处理时间短，微波对目标产物的破坏轻，提取效果好［3－5］。本文采用微波预处理的方法［6］，该法在半干状态下，先用微波辐射破坏植物细胞结构，然后采用传统法进行提取，在单因素试验的基础上，采用正交试验法对微波预处理提取工艺进行了优化，得出了最佳参数组合。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(岛津LC－2010 AHT，岛津Class vp色谱工作站);旋转蒸发仪(R－205，上海申胜生物技术有限公司);电子天平(BP－211D，Sartorius，德国);超声波清洗器(KQ－300E，昆山市超声仪器有限公司);微波炉(MM721AAU－PW，佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司);循环水式真空泵(SHB－3，郑州杜甫仪器厂);微型植物粉碎机(FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)，等。

1.2 材料

白芷药材于2009年11月采自四川省遂宁市，经成都中医药大学马逾英教授鉴定为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f的干燥根，符合中国药典2005年版一部白芷项下的有关规定，阴干，粉碎成不同大小的粉末，备用。所用甲醇、乙醇等化学试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 实验方法

2.1 提取方法

2.1.1 传统提取

取白芷粉末10 g，加入75%乙醇60 mL，回流提取2次，每次提取60 min，过滤，合并滤液，待用。

2.1.2 微波预处理提取

2.1.2.1 称取10 g白芷药材粗粉于表面皿中，滴加一定量汽化剂(一定浓度的乙醇溶液)使之湿润均匀，然后铺平，厚度在3～5 mm左右，静置一段时间，使溶液充分渗入细胞组织内。

2.1.2.2 将湿润好的白芷粉末放入微波炉中进行快速加热预处理，使渗入细胞组织内的乙醇溶液快速汽化。

2.1.2.3 将上述处理过的白芷粉末，加60 mL乙醇后，回流提取60 min，趁热过滤，提取2次，合并滤液至200 mL量瓶中。药渣用乙醇洗涤2～3次，并入滤液，放冷，定容，摇匀，备用。

2.2 白芷中欧前胡素含量测定及方法学考察

2.2.1 色谱条件

色谱柱为 Dikma C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);检测波长:300 nm;流动相:甲醇－水(70∶30);流速:1 mL·min－1;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;理论塔板数按欧前胡素峰计算应不低于3000(图1)。

图1 欧前胡素对照品(A)与白芷提取液(B)的HPLC图

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取欧前胡素对照品4.82 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密量取白芷提取液1 mL，加甲醇定容至10 mL，摇匀，进样前经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取 10 μL 不同浓度(4.82、9.64、19.28、28.92、38.56、48.20 μg·mL－1)的对照品溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积与质量浓度进行线性拟合，得线性方程为Y=6054.7457X+5028.1397，(r=0.999 9，n=6)。结果表明，欧前胡素对照品溶液在4.82 μg·mL－1～ 48.20 μg·mL－1的浓度范围内具有良好的线性关系。

2.2.5 精密度实验

精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6次，按上述色谱条件测定，结果欧前胡素峰面积的RSD为1.70%。

2.2.6 稳定性实验

精密称取同一对照品溶液，分别在 0、2、4、6、8 h测定，按上述色谱条件测定，得出RSD为1.62%，表明被测物在8 h内基本稳定。

2.2.7 重现性实验

同一批号白芷药材按照“2.2.3”项下方法平行制备5份，测定RSD为1.91%，表明方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收率实验

分别精密称取同一白芷药材粉末约0.2 g(约含有欧前胡素0.42 mg)9份，分成高、中、低3组，精密加入相当于样品中含量50%、100%、150%的欧前胡素对照品，按照“2.2.3”项下平行制备供试品溶液，计算得平均回收率为100.74%，RSD为1.29%(表1)。

表1 加样回收试验测定结果

2.2.9 样品含量测定

取白芷提取液样品，平行制备3份供试品，分别吸取10 μL进行测定，计算得提取液中欧前胡素的含量为0.21%(n=3)。

3 结果与分析

3.1 微波预处理汽化剂浓度的影响

称取白芷粉末5份，分别加入2.5 mL· g－1不同浓度(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇，微波辐射150 s，75%乙醇60 mL回流提取2次，每次40 min，提取结果见图2。

图2 汽化剂浓度对欧前胡素提取率的影响

实验中采用乙醇溶液作为预处理汽化剂，从图2可知，乙醇浓度不同，提取率也不同，这与乙醇溶液渗透白芷药材细胞膜效果不同相关，渗透细胞膜效果越好，微波对细胞壁的破坏效果越好，提取率也越高。图2表明乙醇浓度为60%时，欧前胡素含量达最大值，说明此时乙醇溶液渗透白芷细胞膜效果最好。

3.2 微波汽化剂用量的影响

称取白芷粉末 5 份，分别加入 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0倍量的60%乙醇，微波辐射150 s，75%乙醇60 mL回流提取2次，每次40 min，提取结果见图3。

图3 汽化剂用量对欧前胡素提取率的影响

从图3中可看到，随汽化剂用量增加，提取率也增加，到达最大值后，提取率随汽化剂用量增加反而减少。可能原因是:当微波汽化剂用量少时，汽化不充分，同时在一定微波辐射量下汽化剂被蒸干，易导致物料温度过高，细胞被破坏过度，造成部分有效成分损失，影响提取得率;而当汽化剂用量过大时，在一定微波辐射量下，多余的汽化剂蒸发，消耗了微波能，使渗透到细胞内的汽化剂汽化不充分，造成物料温度低，细胞壁破坏不够，提取率不高。图3表明，汽化剂用量为2.5倍量，即2.5 mL· g－1时，提取效果最佳。

3.3 微波预处理时间的影响

以60%乙醇2.5 mL· g－1为汽化剂，分别微波预处理60、90、120、150、180 s，然后用75%乙醇60 mL 回流提取2次，每次40 min。提取结果见图4。

图4 微波辐射时间对欧前胡素提取率的影响

从图4可知，随辐射时间延长，提取率逐渐提高，至150 s时达最大后，提取率迅速下降，存在一个最佳的微波辐射时间。这是由于随着辐射时间增加，物料逐步变干，温度不断上升，细胞被破坏程度逐渐增加，提取率也不断提高;但微波破坏细胞的同时，也会破坏有效成分，辐射时间越长，有效成分损失越多，而且细胞粉碎过细也会造成内传质阻力增大，引起提取率下降。在辐射功率一定的条件下，控制微波辐射时间是为了控制加热程度，以获得最大提取率。图4表明，本实验微波辐射的最佳时间为150 s。

3.4 正交试验优化微波预处理工艺参数

在单因素试验基础上，选取汽化剂用量(A)、汽化剂浓度(B)和微波辐射时间(C)，三个因素分别取三水平进行正交试验，见表2;以白芷欧前胡素的含量为考核指标，用L9(34)正交表安排试验，结果及方差分析见表3、表4。

表2 微波预处理影响因素水平表

表3 正交试验及结果

表4 方差分析表

由极差及方差分析结果可知，影响因素的大小顺序C＞A＞B，微波预处理最优工艺为 C3A3B2，即:微波汽化剂为60%乙醇，用量为物料的2.5倍(mL·g－1)，微波辐射 150 s。

3.6 后续提取时间的影响

以2.5 mL· g－1的60%乙醇为汽化剂，微波辐射150 s，用75%乙醇60 mL回流提取2次，每次分别提取20、30、40、50、60 min 时所得欧前胡素的含量(图5)。

与传统的醇提相似，欧前胡素含量随提取时间的增加而上升，但提取40 min以后含量增加不明显，考虑到实际生产情况，确定后续提取时间为40 min。

图5 后续提取时间对欧前胡素提取率的影响

3.7 后续提取溶剂浓度的影响

以60%乙醇为汽化剂，用量2.5 mL·g－1，微波辐射150 s，分别以55%、65%、75%、85%、95%乙醇60 mL回流提取2次，每次提取40 min，结果见图6。

图6 后续提取溶剂的浓度对欧前胡素提取率的影响

从图6可知，当后续提取乙醇浓度为75%时，白芷欧前胡素的提取效果最佳。

3.8 微波预处理法与传统提取比较

按最优微波预处理条件和确定的后续提取条件，进行白芷欧前胡素提取，结果含量为0.211%，在正交试验结果中较高，表明筛选出来的最适条件可信。微波预处理法与传统提取法进行比较，结果见表5。微波预处理提取法所用时间只有传统提取法的一半，欧前胡素的提取率提高1.11%左右;说明经过微波预处理后，后续提取时间缩短，提取速度大大加快，方法具有可行性。

表5 微波预处理提取法与传统提取法比较

4 结论

4.1 本课题组通过白芷提取工艺的正交试验研究以及对汽化剂乙醇浓度、用量和微波处理时间的深入探讨，确定了微波预处理提取白芷中欧前胡素的最佳工艺参数为:以60%乙醇为汽化剂，用量为2.5 mL· g－1，辐射时间150 s，75%乙醇常规回流提取2次，每次40 min;运用该法所得欧前胡素含量可达到0.211%。

4.2 本研究是在半干状态下，先用微波辐射破坏植物细胞结构，然后进行传统法提取。由于微波作用的是刚好被汽化剂湿润的物料，微波几乎全被物料吸收，处理时间短，微波对目标产物的破坏小，提取效果好，为后续的工艺带来了方便，有着广阔的发展前景。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［S］．北京:化学工业出版社，2005:69．

［2］ 魏玉平，刘俊，颜小林，等．白芷治疗头痛的提取工艺评判指标的研究［J］．中草药，2001，32(4):318．

［3］ 张英，俞卓裕，吴晓琴．中草药和天然植物有效成分提取新技术－微波协助萃取［J］．中国中药杂志，2004，29(2):104．

［4］ 黎海彬，王邕，李俊芳，等．微波辅助提取技术在天然产物提取中的应用［J］．现代食品科技，2005，21(3):148．

［5］ 谢明勇，陈奕．微波辅助萃取技术研究进展［J］．食品与生物技术学报，2006，25(1):105．

［6］ ZHANG Z，XIONG G，LIE G，HE X．Sample pretreatment with microwave－assisted techniques［J］．Anal Sci，2000，16，(2):221．