红发夫酵母生物合成虾青素天然促进剂的研究

张丽敏,华艳艳,孙玉梅,曹 芳

(1.大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;2.大连市农业科学研究院,辽宁大连 116036)

红发夫酵母生物合成虾青素天然促进剂的研究

张丽敏1,华艳艳2,孙玉梅1,曹 芳1

(1.大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;2.大连市农业科学研究院,辽宁大连 116036)

在摇瓶发酵过程中添加富含虾青素合成前体的果蔬汁及茶汁,考察了添加剂对虾青素合成的影响.结果表明:在适当的发酵时间添加橙汁、绿茶汁和番茄汁能明显促进细胞生长及虾青素合成,最高虾青素产量和细胞虾青素含量可分别比对照提高 124%和 128%;添加菠菜汁导致细胞虾青素含量有所降低.

红发夫酵母;虾青素;促进剂

0 前言

虾青素属于酮式类胡萝卜素,呈艳红色,它具有独特的着色功能、极强的抗氧化性,在抗癌变、增强免疫和抗光敏等生物学功能上远强于其他类胡萝卜素,因而在饲料、食品、化妆品及医药等领域具有广阔的应用前景[1-2].目前认为红发夫酵母 (Phaffia rhodozym a)是实现发酵法工业化生产虾青素最具潜力的菌种之一[3].

开发廉价的培养原料、降低发酵成本是红发夫酵母产虾青素研究的主要内容之一.从虾青素生物合成途径可知,番茄红素、β-胡萝卜素等是虾青素合成的重要前体[4],如 Johnson等[5]在培养液中加入番茄汁,使虾青素含量提高到 0.814 mg/g干细胞.胡荣锁等[6]发现,西瓜汁可提高虾青素产量,以 10%的西瓜汁为原料时虾青素产量较高.自然界中许多绿色植物中类胡萝卜素含量都很高,作者选用几种类胡萝卜素含量较高的常见果蔬及茶叶为原料,于不同发酵时期定量添加这些果蔬汁及饮料,考察它们对红发夫酵母生物合成虾青素的影响,以期寻找到成本低廉的虾青素合成促进剂.

1 材料与方法

1.1 菌种

红发夫酵母 (Phaffia rhodozym a)AS 2.1557:中国科学院微生物研究所.

1.2 培养基

种子培养基:葡萄糖 10 g,麦芽汁 (10oBx)3 g,蛋白胨 5 g,酵母膏 3 g,自来水 1 L,pH 6.0.

摇瓶发酵培养基:葡萄糖 20 g,(NH4)2SO45 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl20.1 g,酵母膏 1 g,自来水 1 L,pH6.0.

1.3 培养方法

液体种子:将 2环菌苔接种于装有 25 mL种子培养基的 250 mL三角瓶,于 22℃、210 r/min振荡培养 48 h.

摇瓶发酵:将 2 mL种子液接入装有 23 mL发酵培养基的 250 mL三角瓶,于 22℃、210 r/min振荡培养,定期取样测定.

1.4 测定方法

1.4.1 生物量测定

采用比浊法[7]:取 1 mL发酵液,用纯净水稀释,并以除去菌体的发酵液作空白,测定 500 nm波长下的吸光值.

1.4.2 虾青素提取及测定

二甲基亚砜法[8]:取 2 mL发酵液离心,收集菌体,洗涤 2次,用 1 mL二甲基亚砜 (55℃)破壁,加入 5 mL丙酮提取,3 000 r/min离心 10 min,收集上清液,以二甲基亚砜与丙酮混合液(体积比 1︰5)为空白,测定 480 nm波长下的吸光值.虾青素产量和细胞虾青素含量按以下公式计算:影响较小.在 0 h和 24 h比在 48 h添加橙汁对细胞生长及虾青素合成更有利.

式中:Va为萃取液体积 (mL);A为 480 nm波长下的吸光值;E为比消光系数,即为2 150;Vb为发酵液取样体积 (mL);G为 VbmL发酵液中的细胞干重 (g);10 000,10为单位换算后的余数.

1.4.3 还原糖含量测定

采用 DNS法[9].

1.5 果蔬汁添加液的制备

橙汁 (或番茄汁):鲜橙 (或新鲜红番茄)去皮、榨汁、过滤,收集滤液、灭菌.无菌过滤除去沉淀,得橙黄色橙汁 (或橙红色番茄汁),测定还原糖含量,于 4℃存放、备用.

菠菜汁:新鲜菠菜去根和黄叶,洗净、晾干、称重,700 g菠菜加入 300 mL自来水榨汁、过滤,收集滤液、灭菌.无菌过滤除去固形物,得浅绿色菠菜汁,于 4℃存放、备用.

绿茶汁:绿茶 100 g,加入 55℃自来水 200 mL,于 55℃恒温浸泡 3 h,过滤,收集滤液、灭菌.无菌过滤除去沉淀,得黄绿色茶汁,于 4℃存放、备用.

以上滤液和对照 (自来水)均于 115℃灭菌20 min.

2 结果与分析

2.1 添加橙汁或菠菜汁对虾青素生物合成的影响

分别于摇瓶发酵至 0、24、48 h时添加 2 mL橙汁或菠菜汁,于发酵 60 h和 72 h时取样测定.结果见图 1和图 2.

由图 1可知,分别在发酵 0、24、48 h时添加橙汁,发酵 60 h和 72 h的细胞产量可分别提高54.4%和 49.9%、48.4%和 46.5%、29.3%和36.1%;虾青素产量分别提高 65.5%和 50.9%、71.1%和 43.6%、44.4%和 46.1%;细胞虾青素含量可分别提高 7.2%和 0.38%、15.2%和-2.3%、11.7%和 7.0%.可见,与对照组相比,在发酵 0～48 h添加橙汁,使虾青素产量提高的幅度较大,细胞产量次之,而对细胞虾青素含量的

由图 2可知,分别在发酵 0、24、48 h时添加菠菜汁,发酵 60 h和 72 h的细胞产量可分别提高35.0%和 44.7%、15.4%和 15.5%、6.47%和14.6%;虾青素产量可分别提高 14.6%和12.6%、10.6%和 6.3%、-13.9%和 -3.66%;而细胞虾青素含量则分别降低 8.3%和 15.0%、2.1%和 5.4%、8.0%和 10.8%.可见,在发酵 0～48 h添加菠菜汁,均使细胞虾青素含量明显降低.在 0 h和 24 h添加菠菜汁对提高细胞和虾青素的产量较有利;在 48 h添加菠菜汁,虾青素的合成明显受到抑制.

总体上看,添加菠菜汁不如橙汁对虾青素的生物合成有利.分析原因可能是:其一,菠菜含糖量较少,而橙子中则含有丰富的葡萄糖、果糖、蔗糖等[10](经测定可知,2 mL橙汁可使 25 mL培养基含糖量增加约 4.0 g/L),在补加橙汁的同时也起到了补糖的作用,因而橙汁更能促进菌体生长;其二,橙汁中除含有类胡萝卜素 (含 0.55 mg/100 g)外,还含有维生素、苹果酸、柠檬酸等物质,其中柠檬酸可能是虾青素合成过程中潜在的前体[11],而菠菜中虽然类胡萝卜素含量很高 (含3.87 mg/100 g)[10],但同时还含有较多的草酸和无机盐,制备菠菜汁时,灭菌后出现大量墨绿色的结块,会损失较多的营养物质;其三,菠菜汁中可能含有某些抑制虾青素合成的特殊物质,因此,以后的研究应注意改进菠菜汁的制备工艺,以除去原料中的抑制性物质.

2.2 添加绿茶汁或番茄汁对虾青素生物合成的影响

分别于摇瓶发酵至 0、24、48 h时添加 2 mL绿茶汁或番茄汁,每隔 12 h取样测定.结果见表1.

表1 添加绿茶汁或番茄汁对虾青素生物合成的影响

由表1可知,在 0 h添加绿茶汁,发酵周期不变,细胞产量提高 43%,虾青素产量略有提高,而细胞虾青素含量略有下降;在 0 h添加番茄汁,细胞产量虽较高,但达到最大值的时间拖后 36 h,且虾青素合成明显受到抑制.在 24 h和 48 h添加绿茶汁或番茄汁,均能不同程度促进菌体生长及虾青素合成.在 24 h添加绿茶汁,发酵周期缩短 12 h;在 48 h添加绿茶汁,对细胞产量影响不大,但明显促进虾青素合成,发酵周期延长 24 h时,最高虾青素产量和细胞虾青素含量可分别提高124%和 128%;在 24 h和 48 h添加番茄汁,发酵周期分别延长 48 h和 24 h.可见,在发酵 48 h时(经测定此时发酵液残糖已降至较低水平)添加绿茶汁或番茄汁,比在 0 h或 24 h时添加更能有效促进细胞生长及虾青素合成.

分析可知,番茄汁中不但含有一定量的糖 (2 mL番茄汁可使 25 mL培养基含糖量增加约 1.6 g/L),还含有番茄红素以及较多的有机酸,这些物质均可促进菌体的生长和代谢[12].但较特殊的是,在 0 h添加番茄汁会大大降低虾青素的合成能力,这可能是由于番茄红素的存在而使得虾青素的合成受阻,菌体在利用番茄汁进行生长的同时合成了其他代谢产物.而绿茶中不仅类胡萝卜素含量较高 (含 5.46 mg/100 g),而且还含有较多的类黄酮类物质,其中β-紫罗兰酮是β-胡萝卜素的末端环类似物[13],这些物质可能被菌体利用直接用于合成虾青素.

3 讨论

以上 4种果蔬汁的添加效果表明,以绿茶汁作虾青素合成促进剂具有极为乐观的应用前景;橙汁和番茄汁的添加效果较好,菠菜汁的制备方法还有待于改进.另外,很多研究表明,茶树鲜叶[14-15]可作为原料提取β-D-葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21).该酶同样存在于红发夫酵母细胞内,并可通过调节其活性而使酵母的细胞壁发生变化[16].因而,可考虑以新鲜茶树叶作为原料,经适当处理后在红发夫酵母培养过程中适量添加,有望在促进虾青素合成及减弱酵母细胞壁合成上获得双重效果.

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STUDY ON NATURAL PROMOTER FOR ASTAXANTH IN B I OSYNTHESIS BY USE OFPHAFFIA RHODOZYMA

ZHANGLi-min1,HUA Yan-yan2,SUN Yu-mei1,CAO Fang1
(1.School of B iological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian116034,China)(2.Dalian Academ y of Agriculture Sciences,Dalian116036,China)

The paper studied the effects of additives on the synthesis of astaxanthin by adding fruit-vegetable juice and tea juice rich in synthetic precursor of astaxanthin during shaking flask fer mentation.The results showed that the orange juice,green tea juice and tomato juice added in the proper fermentation time could remarkably promote the cell growth and the synthesis of astaxanthin;the highest astaxanthin yield and the astaxanthin content in cellswere respectively i mproved by 124%and 128%in comparison with the control group;and the addition of spinach juice resulted in the reduction of the astaxanthin content in cells.

Phaffia rhodozym a;astaxanthin;promoter

TS202.3

B

1673-2383(2011)01-0066-04

2010-10-28

张丽敏 (1983-),女,山东威海人,硕士研究生,研究方向为微生物代谢控制发酵.