利用细茎石斛种子胚繁育试管苗的不同培养基研究△

张倩倩，刘守金，俞年军，方成武

(安徽中医学院药学院 安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥 230031)

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利用细茎石斛种子胚繁育试管苗的不同培养基研究△

张倩倩，刘守金*，俞年军，方成武

(安徽中医学院药学院 安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥 230031)

目的：建立细茎石斛Dendrobiummoniliforme(L.)Sw.种子胚的组织培养和快速繁殖方法。方法：在相同的培养条件下，种子胚接种于8种不同培养基上，选择长势相近的试管苗转接于添加不同浓度激素的1/2 MS培养基上，对不同生长状况的试验结果进行统计和分析。结果：比较适合诱导细茎石斛种子萌发的培养基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA，生根的培养基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA，壮苗的培养基1/2 MS+1.2 mg·L-1IBA。结论：适合的培养基对细茎石斛种子胚的生长发育结果有很大差异。

细茎石斛；组织培养；种子胚

细茎石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.又名铜皮石斛，为兰科石斛属多年生附生草本植物，以茎入药，性寒，味甘，具有滋阴清热、益胃生津、消炎止痛、增强免疫力等功效，历来作为石斛品种来源之一。石斛属植物主要分布于我国西南地区，大别山区是该属植物的分布北缘，也是药用优质石斛的主要分布区域，细茎石斛是安徽大别山区野生变家种的品种之一。由于该种的生长与繁殖对环境要求严格，种子缺乏胚乳组织，仅有几个细胞的不成熟胚，自然条件下萌发率极低[1]，加上环境的破坏和人们对野生资源的掠夺性采挖，导致资源的严重匮乏。目前石斛的低繁殖率是制约规模化生产的关键问题。该属植物通过组织培养进行繁殖有许多研究[2]，细茎石斛以茎段为外植体、种子通过组织培养进行繁殖研究较少[3-5]。本试验在已有的研究基础上，对安徽霍山产的细茎石斛种子胚萌发及生根壮苗的培养条件进行培养基筛选研究，优化培养条件，为细叶石斛的规模化生产提供组培苗方面的研究试验探索。

1 材料

细茎石斛的果实于2009年12月采自安徽霍山县太平畈乡，原植物经安徽中医学院刘守金教授鉴定为兰科植物细茎石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.，凭证标本ZH001存于安徽中医学院标本馆(ACM)。

2 方法

2.1 种子胚萌发培养

将细茎石斛的果实冲洗干净，置0.1 %升汞试液中表面消毒8 min，无菌水冲洗3次，再用75 %乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3次；用无菌镊子撕开果皮，轻轻抖动，把种子散落到加入无菌水的小烧杯中，使种子呈悬浮状态；用吸管吸取悬浮液，分别接种在1/2 MS、1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA、MS、MS+1.0 mg·L-1NAA、KC、KC+1 mg·L-1NAA、B5、B5+1.0 mg·L-1NAA的培养基上，每种培养基各10瓶，观察100 d记录。

2.2 生根壮苗培养

从细茎石斛种子胚培养出的幼苗中，选取高度、长势相近，没有生根的幼苗转接到1/2 MS培养基中，分别加激素NAA浓度为0.5，1.0，1.5，2.0 mg·L-1；激素IBA浓度为0.1，0.4，0.8，1.2 mg·L-1的培养基上，每种10瓶，每瓶接种6个小苗，观察90 d记录。

2.3 培养条件

培养温度25 ℃，前5 d为暗培养，后期光照强度2 500 lx，光照时间10 h·d-1，湿度75 %。

2.4 观察记录项目

观察种子萌发情况和在不同培养基上试管苗的长势情况，包括转绿时间、原球茎形成时间、形态分化时间、形成丛生芽的形态、平均苗高、苗壮度、叶色、叶长；平均根长、根数、根长势、平均株高、丛生苗数、叶长/宽、叶色、健壮度。

3 结果

3.1 不同培养基配方对细茎石斛种子胚的萌发和原球茎分化的影响

组织培养18 d后，1/2 MS+NAA培养基中种子胚最先转绿，1/2 MS、MS、MS+NAA、KC、KC+NAA、B5+NAA培养基中种子胚陆续转绿，并逐渐膨大，B5培养基中种子未见萌发转绿，见表1。

35 d后，1/2 MS+NAA培养基中形成原球茎，单个原球茎呈小圆锥状，或多个呈桑椹状，单个原球茎直径达到0.6～0.8 cm。原球茎顶端有鳞片状的叶原基突起，呈深绿色；MS、MS+NAA培养基中原球茎较小，直径最大达到0.4 cm，呈淡黄绿色。KC+NAA、KC培养基中原球茎直径最大达到0.5 cm，呈翠绿色。B5+NAA培养基中原球茎小，直径仅有0.2 cm。B5培养基中未形成原球茎，见表1。

45 d后，1/2 MS+NAA培养基中原球茎大量分化，形成茎、芽，均粗壮，叶片多，颜色深，叶最长约1.0 cm，苗最高达到1.2 cm，长势很好。KC和KC+NAA培养基中，苗大量丛生，成簇状，但苗比1/2 MS和1/2 MS+NAA细小。MS、KC培养基中原球茎没有分化，见表2。

表1 不同培养基对细茎石斛原球茎形成的影响

表2 不同培养基对细茎石斛幼苗发育的影响

注：+-不发达；++ - 一般发达；+++ -较发达；++++ -最发达

3.2 不同浓度的IBA激素对细茎石斛壮苗的影响

观察1/2 MS培养基中，加浓度分别为0.1，0.4，0.8，1.2 mg·L-1的激素IBA，平均株高、叶片长度/宽度逐渐增加，叶片颜色逐渐变深，苗逐渐粗壮。平均根长逐渐增长、根数增多，根由细、小长为粗、长。当IBA激素浓度达到1.2 mg·L-1时，苗最健壮，见表3。

表3 不同浓度的IBA激素对细茎石斛壮苗的影响

注：+-不发达；++ - 一般发达；+++ -较发达；++++ -最发达

3.3 不同浓度的NAA激素对细茎石斛生根的影响

在1/2 MS培养基中添加不同浓度NAA组中，浓度为0.5 mg·L-1和1.5 mg·L-1的两组植株均白化死亡。由表4观察出，浓度为1.0 mg·L-1时，生根率达到了100 %，根长、粗、壮，并且丛生苗多，叶大、色深，苗长势健壮。浓度为2.0 mg·L-1时，平均根长达到了1.2 cm，生根率为80 %，根粗、壮。丛生苗达到3个，叶大，但有很多黄叶。

表4 不同浓度的NAA激素对细茎石斛生根的影响

注：++ -一般发达；+++ -较发达

4 结论与讨论

通过8种不同培养基对细茎石斛种子萌发和分化影响的比较研究，结果表明,在1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培养基，种子胚培养约18 d种子开始变绿，并逐渐膨大；培养35 d后观察，由种子形成的原球茎比较均匀，直径在0.6～0.8 cm。其后原球茎上端开始有芽形成，45 d后观察幼苗形成。1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培养基对细茎石斛的原球茎形成、分化时间最短，幼苗平均高达到了1.2 cm，茎粗、壮，叶最长1 cm，叶片多，颜色深，长势最好。在KC+NAA培养基组中，种子胚通过培养产生大量簇生的幼苗，但苗较1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培养基萌发的苗细小。试验结果提示在同类培养基中，添加NAA激素组的种子萌发情况均好于不添加激素组。MS、B5和B5+NAA培养基均不适合细茎石斛的种子萌发。

在比较1/2 MS培养基中添加不同浓度IBA对生根的影响中，当激素IBA浓度为1.2 mg·L-1时，苗的长势相对较好，生根率达到80 %，平均根数及平均根长均最好，1/2 MS +1.2 mg·L-1IBA是壮苗和生根的最适培养基。

[1] 张明，夏鸿西，朱利泉，等.石斛组织培养研究进展[J].中国中药杂志，2000，25，(6)：323-326.

[2] 明兴加，冯婷婷.中国石斛属植物种苗繁育技术的研究进展[J].安徽农业科学，2010,38(6)：2899-2902，2920.

[3] Choi SK, Lee DK. The study on the artificial propagation ofDendrogiummoniliformein wild medicinal herb[J]. The Research Reports of the Rural Development Administration,1989, 31(3): 52-56.

[4] 王再花,涂红艳,叶庆生.细茎石斛的快速繁殖和试管开花诱导[J].植物生理学通讯,2006,42(6)：1143-1144.

[5] 田雪琪,张铁.细茎石斛组织培养研究[J].文山师范高等专科学校学报,2007,20(3)：114-116.

TissueCulturingandRapidPropagationofDendrobiummoniliforme(L.)Sw.

ZHANG Qian-qian, LIU Shou-jin, YU Nian-jun, FANG Cheng-wu

(SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,AnhuiKeyLaboratoryofModernTraditionalChineseMedicine,Hefei, 230031,China)

Objective:To established the optimal medium and culture condition for in vitro culture and rapid propagation of embryo ofD.moniliforme.Methods: The embryo was inoculated and cultivated in 8 different kinds of culture medias under the same culture condition.The same length of seeding was inoculated in 1/2 MS solid medium with different concentrations of hormones (NNA and IBA).Results:1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for embryo germination,and 1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for the developing of roots;and 1/2 MS containing 1.2 mg·L-1IBA is the best media for plantlet strengthening.Conclusion: Tissue culture is effective way in the rapid propagation for large-scale production ofD.moniliforme.

Dendrobiummoniliforme; Tissue culture; Embryo.

安徽省自然基金项目(090413110)，安徽省高校省级自然科学研究重点项目(KJ2010A203)

*刘守金，Tel：(0551)5169306,E-mail：liushjin@hotmail.com

2010-12-09)