HPLC同时测定复方二甲硝咪唑可溶性粉中地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶的含量*

冯学忠,黎华鹏,盘苑芷,方炳虎,张魁华

(1.广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴 527400;2.华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)

复方二甲硝咪唑可溶性粉又称复方地美硝唑可溶性粉,其主要成分为地美硝唑[1]、甲氧苄啶[2]、磺胺对甲氧嘧啶[3]。本品为广谱抗菌和抗球虫药,对革兰阴性菌(鸡巴氏杆菌、大肠埃希菌、沙门菌等)、革兰阳性菌(化脓性链球菌、肺炎球菌等)、鸡球虫、组织滴虫和猪痢短螺旋体等均有良好作用[4-6]。主要用于防治鸡的巴氏杆菌病、大肠埃希菌病、球虫病、伤寒及家禽的肺炎、肠炎等。复方二甲硝咪唑可溶性粉在《进口兽药质量标准》1999年版中是采用高效液相色谱法测定含量[7-8],其是采用甲醇-水不同比例的流动相,不同的检测波长分别测定甲氧苄啶、地美硝唑与磺胺对甲氧嘧啶。本试验通过优化色谱条件,建立了同时测定上述3种成分含量的高效液相色谱法,其具有简便可行、准确、快速的特点,减少了配制流动相、稀释样品、进样次数等实验步骤,提高了工作效率,取得了满意效果,可为完善该制剂的质量标准提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;CP225D型电子天平,德国赛多利斯有限公司;pHS-3C型精密pH计,上海精密科学仪器有限公司。

1.1.2 药品 地美硝唑对照品,批号为H 0390906,含量99.9%,中国兽医药品监察所;甲氧苄啶对照品,批号为 H 0160704,含量100.0%,中国兽医药品监察所;磺胺对甲氧嘧啶对照品,批号为H 0300904,含量100.0%,中国兽医药品监察所;复方二甲硝咪唑可溶性粉,规格为100g:地美硝唑8.0g+磺胺对甲氧嘧啶7.4g+甲氧苄啶2.0g,批号为20100501,20100502,20100503,广东大华农动物保健品股份有限公司;磷酸为分析纯;乙腈、甲醇为色谱纯;水为纯化水。

1.2 方法

1.2.1 地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶波长的确定 精密称取地美硝唑对照品、甲氧苄啶对照品、磺胺对甲氧嘧啶对照品适量,用500mL/L甲醇溶液分别制成每1 mL中含10、5、10μg的标准溶液。以500mL/L甲醇溶液为空白,按照紫外分光光度法,在190 nm～500 nm波长范围内进行紫外吸收图谱扫描,并确定检测波长。

1.2.2 1 g/L磷酸溶液 取磷酸1.18mL,加水适量使成1 000 mL,摇匀,备用。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:Discovery C18,尺寸:250 mm×4.60mm,5μm;流动相:1 g/L磷酸溶液-乙腈(90:18);检测波长:230 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:20μL。

1.2.4 标准储备液的制备

1.2.4.1 地美硝唑标准储备液 精密称定地美硝唑对照品27m g,置50mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀释至刻度,制成0.54 mg/mL溶液,摇匀,作为标准储备液。

1.2.4.2 甲氧苄啶标准储备液 精密称定甲氧苄啶对照品27 mg,置200mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀释至刻度,制成0.135 mg/mL溶液,摇匀,作为标准储备液。

1.2.4.3 磺胺对甲氧嘧啶标准储备液 精密称定磺胺对甲氧嘧啶对照品25 mg,置50 mL容量瓶中,加500 mL/L甲醇溶液使其溶解并稀释至刻度,制成0.5mg/mL溶液,摇匀,作为标准储备液。

1.2.5 标准曲线的绘制

1.2.5.1 地美硝唑标准曲线 精密吸取上述1.2.4.1标准储备液 1、2、3、4、5 mL,分别置于25 mL的容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀;制成浓度分别为 20、40、60、80、100 μg/mL 的标准溶液,照高效液相色谱法测定。

1.2.5.2 甲氧苄啶标准曲线 精密吸取上述1.2.4.2标准储备液 1 、2 、3、4、5、6 mL,分别置于100 mL的容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀 ;制成浓度分别为 5、10 、15、20、25 、30 μg/mL的标准溶液,照高效液相色谱法测定。

1.2.5.3 磺胺对甲氧嘧啶标准曲线 精密吸取上述 1.2.4.3 标准储备液 1、2、3、4 、5mL,分别置于25 mL的容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀;制成浓度分别为 20、40、60、80、100 μg/mL 的标准溶液,照高效液相色谱法测定。

1.2.6 稳定性试验 精密称定复方二甲硝咪唑可溶性粉(批号:20100501)约 338 mg,置50 mL容量瓶中,加500mL/L甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5 mL,置50 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度 ,摇匀,放置 0、0.5 、1.0、1.5、2.0、2.5 h,照高效液相色谱法进行测定。

1.2.7 系统适应性 精密称定复方二甲硝咪唑可溶性粉(批号:20100501)约 338m g,按 1.2.6方法进行稀释并检测。

1.2.8 空白试验 按处方比例称取辅料适量,制备不含地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶的空白样品,按1.2.6项下方法进行稀释并进行测定。

1.2.9 回收试验 精密称定地美硝唑对照品、甲氧苄啶对照品、磺胺对甲氧嘧啶对照品适量,按处方量加入其他辅料,制成其含量为标示量的80%、100%、120%三种样品,分别按1.2.6项下方法稀释并测定其峰面积。

1.2.10 精密度试验 精密称定复方二甲硝咪唑可溶性粉(批号:20100501)约338 mg,按1.2.6项下方法进行溶解稀释,摇匀,作为测定复方二甲硝咪唑可溶性粉精密度试验用溶液,重复测定5次,进行精密度试验,照高效液相色谱方法进行测定,按外标法以峰面积计算。

1.2.11 样品含量测定 取批号 20100501,20100502,20100503的复方二甲硝咪唑可溶性粉,分别精密称定约338 mg,按1.2.6项下方法溶解稀释,摇匀,作为供试品溶液;另外精密吸取1.2.4项下的标准储备液各5 mL置同一个50 mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液,按1.2.3项下的色谱条件测定,用外标法计算样品中地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶的含量。

2 结果

2.1 检测波长结果

在190 nm～500 nm波长范围内进行紫外吸收图谱扫描显示,在波长230 nm处分别都有最大吸收或较大吸收分别见(图1～图3)。因此,选择230 nm为检测波长。

2.2 标准曲线

2.2.1 地美硝唑标准曲线 结果见表1。以峰面积(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标进行线性回归,得到标准曲线方程:A=25.58C+4.31(r=1,n=5,C的单位为 μg/mL)。结果表明,在 20μg/mL～100μg/mL的浓度范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系(图4)。

表1 地美硝唑标准溶液的峰面积Table1 The peak-area of standard solution of dimetridazole

图1 地美硝唑紫外吸收图谱Fig.1 The UV spectrum of dimetridazole

图2 甲氧苄啶紫外吸收图谱 Fig.2 The UV spectrum of trimethoprim

图3 磺胺对甲氧嘧啶紫外吸收图谱Fig.3 The UV spectrum of sulfamethoxydiazine

图4 地美硝唑标准曲线Fig.4 The standard cu rve of dimetridazole

2.2.2 甲氧苄啶标准曲线 结果见表2。以峰面积(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标进行线性回归,得到标准曲线方程:A=99.37C-6.53(r=0.999 9,n=6,C的单位为μg/mL)。结果表明,在5μg/mL～30 μg/mL的浓度范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系(图5)。

表2 甲氧苄啶标准溶液的峰面积Table2 The peak-area of standard solution of trimethoprim

2.2.3 磺胺对甲氧嘧啶标准曲线 结果见表3。以峰面积(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标进行线性回归,得到标准曲线方程:A=64.35C+6.35(r=1,n=5,C的单位为μg/mL)。结果表明,在20μg/mL～100μg/mL的浓度范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系(图6)。

表3 磺胺对甲氧嘧啶标准溶液的峰面积Table3 The peak-area of standard solu tion of su lfamethoxydiazine

图5 甲氧苄啶标准曲线Fig.5 The standard cu rve of trimethoprim

图6 磺胺对甲氧嘧啶标准曲线Fig.6 The standard curve of su lfamethoxydiazine

2.3 稳定性试验结果

从表4可见,复方二甲硝咪唑可溶性粉在2.5 h内峰面积基本保持不变,稳定性良好。

表4 复方二甲硝咪唑可溶性粉的稳定性试验结果Table4 The stability result of compound dimetrdazolie solub le pow der

图7 高效液相色谱图Fig.7 High performance liquid chromatogram

2.4 系统适应性结果

连续进样6次,所得峰面积的RSD分别为地硝咪唑0.26%,甲氧苄啶 0.16%,磺胺对甲氧嘧啶0.02%。理论板数分别为按地美硝唑峰计算,理论板数为 17417;按甲氧苄啶峰计算,理论板数为15881;按磺胺对甲氧嘧啶峰计算,理论板数为20083。保留时间分别约为地美硝唑5.0 min,甲氧苄啶8.2 min,磺胺对甲氧嘧啶11.9min。地美硝唑峰、甲氧苄啶峰和磺胺对甲氧嘧啶峰的分离度符合要求(图7)。

2.5 空白试验结果

结果在其3种成分的保留时间处均无吸收,不干扰测定,符合要求。

2.6 回收试验结果

结果见表5,根据其标准曲线,分别求出地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶的回收率,平均回收率分别为99.87%、99.83%和99.57%,RSD分别为0.73%、1.46%和0.85%。

结果表明,复方二甲硝咪唑可溶性粉回收率试验符合要求。

2.7 精密度试验结果

复方二甲硝咪唑可溶性粉中3种成分含量的RSD分别为(地美硝唑)0.22%、(甲氧苄啶)0.15%、(磺胺对甲氧苄啶)0.03%,结果见表6。结果表明,本法具有良好的精密度。

2.8 样品含量测定结果

结果见表7。结果表明,复方二甲硝咪唑可溶性粉的含量符合要求。

3 讨论

3.1 流动相的选择

《进口兽药质量标准》1999年版中是选用液相色谱中最基础溶剂组合甲醇-水作为流动相,结果色谱峰拖尾严重,分离度及柱效较低。曾试用乙腈-水组合作为流动相结果也是一样。鉴于地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶等成分具有弱碱性,考虑在流动相中使用偏酸性的缓冲液,这样可以改善峰形,防止拖尾,分离效果较好。通过对缓冲液种类,浓度,有机溶剂,流动相配比等影响分离效果的参数进行多次选择优化,最终确定用0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)作为流动相。

表5 回收率试验结果Table5 Recovery test results

表6 精密度试验结果Table6 Precision of compound dimetrdazolie soluble powder

表7 样品含量结果Table7 conten t of the sample results

3.2 检测波长的选择

本试验对地美硝唑、甲氧苄啶和磺胺对甲氧嘧啶3种对照品溶液进行了190 nm～500 nm紫外光谱扫描,结果表明,地美硝唑在316 nm、228 nm 和197 nm出有最大吸收,在230 nm处有较强吸收;甲氧苄啶在280 nm和204 nm处有最大吸收,在230 nm处也有较强吸收;磺胺对甲氧嘧啶在270、230、212、197 nm处有最大吸收。考虑到在200 nm附近存在“边缘效应”,溶剂在此波长下也有紫外吸收,会对检测带来较大影响;而且甲氧苄啶在样品中含量较低,地美硝唑和磺胺对甲氧嘧啶在样品中含量较高,为了提高甲氧苄啶检测灵敏度,减少3个成分峰之间峰高的差别,所以选择了230 nm作为检测波长。

3.3 试验可行性

在所选定色谱条件下,对样品中的地美硝唑、甲氧苄啶和磺胺对甲氧嘧啶等成分进行测定,发现各峰之间均无干扰,各峰的分离度均大于1.5,而且峰形较好,对样品进行回收率试验亦证明了此法同时测定复方二甲硝咪唑可溶性粉中三种主要成分是一种简便、有效、准确的方法。在实际应用过程中,针对某一种样品,可通过调节流动相配比来控制分析时间,提高分析效率。此外,操作过程简单,减少样品在处理过程中的损失,定量更准确,易于推广。

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[6]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典·兽药使用指南·化学药品卷二 00五年版[M].北京:中国农业出版社,2006:70.

[7]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二00五年一部[M].北京:中国农业出版社,2006:附录32-35.

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