广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定*

韦达有,伍和明,蒋家霞,付 薇,孙翔翔,何奇松,马 琳,徐贤坤*

(1.广西桂林市动物疫病预防控制中心,广西桂林 541002;2.广西区动物疫病预防控制中心,广西南宁 530001)

广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定*

韦达有1,伍和明1,蒋家霞2,付 薇2,孙翔翔2,何奇松2,马 琳2,徐贤坤2*

(1.广西桂林市动物疫病预防控制中心,广西桂林 541002;2.广西区动物疫病预防控制中心,广西南宁 530001)

用SPF鸡胚从广西地区猪群中分离到1株H9N2型猪流感病毒(SIV),经鸡胚接种3代后出现稳定的鸡血红细胞凝集效价为27,且凝集性能被H9亚型阳性血清抑制,而不被其他亚型流感病毒阳性血清所抑制。分离株的HA基因及NA基因扩增结果显示,该毒株HA基因与流感病毒H9亚型同源性最高,NA基因与流感病毒N2亚型同源性最高,说明该病毒属于H9N2亚型猪流感病毒,命名为A/Swine/Guangxi/01/2009。

猪流感病毒;H9N2亚型;分离鉴定;HA基因;NA基因

猪流行性感冒(Swine influenza,SI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病,临床上以突然发病、高热、咳嗽、呼吸困难、反复发作、衰竭为特征[1]。目前,SI已遍布美洲、亚洲、非洲、欧洲等世界各地,由于流感病毒可以在猪体内发生基因重排,具有感染人和禽的潜力,因此不仅对养猪业造成巨大的威胁,而且具有重大公共卫生意义[2-4]。

本研究对广西地区疑似感染猪流感病毒的猪群采集鼻咽棉拭子及发病猪肺组织病料,进行病毒分离鉴定。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂 灭菌生理盐水,双抗(青霉素、链霉素各1 000单位/mL),10 ml/L鸡红细胞均由本实验室配制;流感病毒的HA、NA亚型参照抗原和相应的抗血清、新城疫病毒(NDV)标准阴阳性血清均由哈尔滨兽医研究所惠赠;RNA抽提试剂盒购自北京天根科技公司,RT-PCR试剂、PMD-18T载体、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2 病料 从广西桂林市牲畜屠宰场采集的猪肺组织。

1.1.3 SPF鸡胚 购自北京梅里亚维实验动物技术有限公司。

1.1.3 引物序列 反转录引物为通用引物Uni12(参考国标)。根据GenBank中已发表的序列,通过Oligo软件设计两对用于克隆HA和NA基因序列的特异性引物,所有引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,引物序列见表1。

表1 扩增HA和NA基因所用引物Table 1 The primers used for amplified HA and NA genes

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 将研磨好的猪病料3 000 r/min离心3 min取上清液,经双抗处理后接种9日龄～11日龄SPF鸡胚(0.2 mL/枚),收取24 h～96 h内培养的鸡胚,4℃过夜收集病毒尿囊液,稀释后经SPF鸡胚连续传3代,测定HA效价。

1.2.2 血凝与血凝抑制(HA-HI)试验 用微量血凝板法检测收集的尿囊液血凝活性,用H1至H16亚型和ND标准阳性血清和阴性血清、生理盐水等进行常规血凝抑制试验,测定HI效价,鉴定此病毒。

1.2.3 神经氨酸酶抑制(NI)试验 用9种NA(N1～N9)亚型流感病毒参照抗原及相应的抗血清,参考WHO提供的方法,进行交叉NI反应,鉴定病毒的NA亚型。

1.2.4 HA和NA基因的RT-PCR扩增 取200 μ L含病毒的鸡胚尿囊液用RNA抽提试剂盒提取病毒RNA,然后进行RT-PCR反应。

RT 体系(25 μ L):RNA 模 板 15 μ L,5 ×MMLV RTase Reaction buffer5 μ L,dNTPs(10 mmol/L)2 μ L,Uni12 引物(25 pmol/L)2 μ L,Rnasin inhibitor(40 U/(L)0.5 μ L,M-MLV RTase(200 U/(L)0.5 μ L。反应条件为42℃1 h;95℃,5 min,反应结束获得cDNA。

PCR 体系 (25 μ L):cDNA 5 μ L,10 ×ExTaqBuffer 2.5 μ L,MgCl2(2.5 mmol/L)2 μ L,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μ L,上、下游引物(25 pmol/L)各0.5 μ L,ExTaq酶 (5 U/(L)0.3 μ L,ddH2O 12.2 μ L。反应条件为95℃预变性 5 min;95℃变性50 s,56℃退火50 s,72℃延伸60 s,共35个循环;最后72℃延伸10 min。反应结束后10 g/L琼脂糖凝胶电泳,置凝胶成像系统中观察结果。

1.2.5 HA基因和NA基因的克隆与序列分析将PCR产物按照宝生物工程(大连)有限公司提供的PCR产物胶回收试剂盒说明进行目的带回收。纯化回收产物与pMD18-T连接,将连接产物转化到DH5α感受态细胞中培养,经涂布于 LB平板上,37℃培养16 h;挑取白色菌落接种到含有 Amp+(100 μ g/mL)5 mL的 LB液体培养基中,37℃摇床培养16 h;抽提重组质粒并进行酶切及PCR鉴定。筛选出阳性质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。将测序结果与国内外已发表的基因序列利用DNA Star软件进行核苷酸同源性分析,并绘制遗传进化树。

2 结果

2.1 血清亚型鉴定

2.1.1 HA-HI试验 接种后收集鸡胚尿囊液对10 mL/L鸡红细胞的凝集反应,结果 HA效价为27。HI试验结果表明,分离毒株与H9亚型流感病毒阳性血清血凝抑制效价为27,而与其他流感病毒血清亚型和NDV阳性血清和阴性血清均没有抑制反应。

2.1.2 NI试验 神经氨酸酶抑制试验结果表明,参照抗原均被相应的阳性血清抑制,分离毒株NI交叉试验中只被N2亚型阳性血清抑制,而其余8个亚型阳性血清均为阴性,表明此株病毒为N2亚型流感病毒。

2.2 HA基因和NA基因扩增

HA、NA两个基因经RT-PCR扩增,产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳获得大小分别为 615 bp和529 bp的片段(图 1),扩增片段大小与预期长度一致。

图1 HA基因和NA基因RT-PCR产物Fig.1 T he RT-PCR products of HA and NA genes

2.3 HA和NA基因序列分析

将分离到的猪流感毒株(命名为A/Swine/Guangxi/01/09)的HA和NA基因序列(表2)分别与从GenBank下载H1至H16的HA基因序列、N1至N9的NA基因序列进行比较,并绘制遗传进化树。

2.3.1 HA基因序列分析

2.3.1.1 同源性分析 扩增得到的分离株的HA基因与流感病毒H9亚型核苷酸同源性最高,达到82.9%～96.4%,其中与H9N2亚型猪源、禽源、人源流感病毒参考株同源性分别为96.4%、93.7%、88.4%。而与其他亚型的同源性均在60%以下(图 2)。

2.3.1.2 遗传进化树分析 分离株的HA基因序列与山东猪流感病毒、北京禽流感病毒、香港人流感病毒的H9N2亚型毒株在最近的分支上,同时与H9N4和H9N6分支也较近,而与其他亚型的HA基因序列遗传进化关系较远(图3)。

表2 流感病毒HA和NA基因参考序列Table 2 T he reference HA and NA genes of influenza virus in this analysis

图2 广西分离株与参考毒株HA基因的核苷酸同源性比较Fig.2 The homology of nucleotide sequence about HA gene among influenza viruses

图3 HA基因核苷酸遗传进化树Fig.3 The phylogenetic tree analysis for nucleotide of HA gene

2.3.2 NA基因序列分析

2.3.2.1 同源性分析 分离株的NA基因与流感病毒N2亚型核苷酸同源性最高,达到94%～83.5%,其中与H9N2亚型猪源、禽源、人源流感病毒参考株同源性分别为93.5%、94%、89.3%。而与其他亚型的同源性均在80%以下。

2.3.2.2 遗传进化树分析 分离株的NA基因序列与山东猪流感病毒、北京禽流感病毒、香港人流感病毒 H9N2亚型毒株在最近的分支上,同时与H2N2和H5N2分支也较近,而与其他亚型的 NA基因序列遗传进化关系较远(图4)。

图4 NA基因核苷酸遗传进化树Fig.4 Phy logenetic tree analysis for nucleotide of NA gene

3 讨论

猪流感自1918年美国首次报道,至今在猪群中已流行近百年。我国猪流感于1969年台湾首次报道,主要是由H1N1和H3N2亚型流感病毒引起;H9N2亚型流感病毒最初只在禽类以低致病性感染蔓延,1998年从香港猪中首次分离到,随后1999年中国大陆和香港先后从疑似流感人群中分离到H9N2亚型流感病毒,序列分析发现其所有基因片段与早期H9N2亚型禽流感病毒高度同源[5-7]。近几年,猪源H9N2亚型流感病毒在中国大陆也时有报道,而且引起了一定的发病率和死亡率,说明该亚型毒株已突破禽种间屏障进入猪群并在猪群中生息演化[8]。

目前,在猪群中流感病毒主要以H1N1、H3N2和H1N2亚型为主;猪作为流感病毒的易感动物,同时也是流感病毒“禽-猪-人”传播链中的重要中间宿主和“混合器”,流感病毒能在猪体内发生变异和基因重排。在我国华南地区,环境和生活方式的原因,给水禽、家禽、猪、人之间提供了更多接触的机会,引起流感病毒的跨种间传播和遗传变异;基因重排H9N2亚型流感病毒从禽到猪的跨种间传播目前已经被证实,而且有趋势通过基因重排产生适应哺乳动物的新流感毒株,从而导致人类流感的大流行,如同猪流感病毒 H1N1、H1N2和H3N2[9-10]。因此,H9N2亚型猪流感对人类健康有潜在的威胁,具有重大的公共卫生意义。

本研究通过HA-HI试验及HA和NA基因序列的分析表明,从广西猪体分离出的流感病毒属于H9N2亚型,核苷酸同源性和遗传进化分析,其HA基因与猪源H9N2亚型流感病毒参考株同源性最高达到了96.4%,而NA基因则与禽源H9N2亚型流感病毒参考株同源性最高达94%,可知此株流感病毒是禽流感病毒在猪体上得到了适应。这为广西区猪流感疫情动态和防控及人流感预防监测提供了重要依据。

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Isolation and Identification of a Subtype H9N2 Influenza Virus From Swine

WEI Da-you1,WU He-ming1,JIANG Jia-xia2,FU Wei2,SUN Xiang-xiang2,HE Qi-song2,MA Lin2,XU Xian-kun2

(1.Guilin Center f or Animal Disease Prevention and Control,Guilin,Guangxi,541002,China;2.Guangxi Center f or Animal Disease Prevention and Control,Nanning,Guangxi,530001,China)

A H9N2 subtype strain of swine influenza virus(SIV)was isolated from swine in Guangxi by SPF chicken embryo.The SIV strain had a stable haemagglutiain(HA)values for 27after there generations,and can be inhibited by H9 positive serum.The HA and NA genetic amplification showed that this strain had the height homology with the subtype H9N2 SIV,which named A/Swine/Guangxi/01/2009.

SIV;H9N2 subtype;isolation and identification;HA gene;NA gene

S852、659.6;S858.28

B

1007-5038(2011)07-0113-05

2011-01-24

广西自然科学基金(2010GXNSFD013033)

韦达有(1965-),男,广西桂林人,兽医师,主要从事动物疫病防控工作。*通讯作者