斯氏并殖吸虫感染犬肝、肺组织中JAK-STAT和 NF-Κ β 的表达*

李珍炼，黄玉清，张锡林，陈文碧，王光西

并殖吸虫病（paragonimiasis，又称肺吸虫病）是一类重要的食源性人兽共患寄生虫病，广泛分布于亚洲、非洲与拉丁美洲许多国家[1]。肺吸虫的种类较多，我国以卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫居多，由于并殖吸虫成虫与童虫均具有游走性，在人体除引起肺部病变外，还可移行至肝脏、心包、睾丸、皮下组织，特别是幼虫可经纵隔、颈部移行至颅内，侵犯脑组织，可表现为癫痫、脑炎、偏瘫，危害严重。虫体在组织器官内移行、寄居的机械破坏作用，虫体代谢产物引起的免疫病理反应，可导致肝、肺、脑出现炎症、出血、脓肿、囊肿、纤维化等病理改变[2]。临床表现极其复杂。近年来研究显示众多信号通路参与了全身性炎症反应和组织损害的病理过程。细胞因子受体介导的 JAK-STAT[3]（janus kinase/signal transducerand activator of transcription，JAKSTAT）通路广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡以及炎症、肿瘤的发生等病理生理过程，对机体产生重要影响；核转录因子-Κ β（nuclear factor-kappaB ，NFΚ β）是一类重要的核转录因子[4]，广泛存在于真核生物中。体内外的多种刺激，如缺氧、缺血、氧化应激，炎症反应等均可激活 NF-Κ β；然而关于其在肺吸虫病损伤的肝、肺组织中的表达变化和意义少有报道。本实验以腹腔注射囊蚴感染法建立肺吸虫病动物模型，旨在观察JAK-STAT和 NF-Κ β通路在斯氏并殖吸虫所致肝、肺组织损伤中的表达及其作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验动物 溪蟹采自四川省兴文县先锋镇肺吸虫病流行区；健康清洁级家犬，共10只，由泸州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要实验试剂 兔抗人STAT多克隆抗体、兔抗人NF-kB（P65）多克隆抗体、辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP）购于Sigma公司，二氨基联苯胺（DAB），多聚甲醛，戊巴比妥钠，10%福尔马林。

1.2 实验方法

1.2.1 建立肺吸虫病感染动物模型 将采自肺吸虫病流行区的溪蟹洗净、研碎、过滤、沉淀，在解剖显微镜下分离囊蚴，采用腹腔注射囊蚴法感染家犬，感染组8只，每只犬注射200个囊蚴，不感染的犬2只，为正常对照组，饲养观察三个月。

1.2.2 动物解剖和取材 感染三月后解剖犬，自肺虫囊取出虫体，经鉴定为斯氏并殖吸虫成虫。取肺、肝组织；用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察组织病理变化；以免疫组化染色法检测肺和肝组织STAT和NFΚ β的表达 。

1.2.3 免疫组化法检测 STAT和NF-Κ β的表达测定步骤：组织切片，常规脱蜡水化后，蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡，高温抗原修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，并用正常山羊血清封闭交叉反应。滴加一抗即兔抗人STAT多克隆抗体（1∶200）、兔抗人NF-kB（P65）多克隆抗体（1∶200）孵育，PBS 冲洗后滴加生物素标记二抗即羊抗兔IgG室温孵育20min，PBS冲洗后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/H RP）孵育 ，PBS冲洗 ，DAB 显色，苏木素复染，透明，封片观察。免疫组化同时加作阴性对照片（PBS代替一抗）。

STAT和NF-Κ β结果判断：阳性细胞为细胞染成棕黄色或有棕黄色颗粒沉积，定位于细胞核和细胞浆。由二位病理医生按双盲法对免疫组化结果进行评估，即在高倍镜下（×200）随机观察10个视野，计数1 000个细胞中的阳性细胞数，计算出阳性细胞百分率。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，进行多因素方差分析，两组间比较用t检验，P＜0.05差异有统计学意义，所得数据以均数±标准差表示。

2 结 果

2.1 H E染色光镜观察结果 观察到感染犬肺和肝切片斯氏并殖吸虫虫卵周围有大量的炎症细胞浸润。感染犬肺可见虫体隧道，肺泡上皮坏死，炎症细胞浸润；肝组织可见虫体隧道，肝细胞坏死，炎症细胞浸润，见大片坏死并有大量嗜酸性粒细胞浸润及嗜酸性脓肿形成，坏死周围肉芽肿及纤维组织包裹，见夏科-雷登氏结晶；肝细胞气球样变，萎缩、变性、坏死，肝细胞核浓缩，界限不清；汇管区水肿，伴炎性细胞浸润，肝窦扩张、瘀血；小胆管及结缔组织增生，有虫卵沉积坏死灶。

2.2 免疫组化结果

2.2.1 犬肺组织中 JAK-STAT和NF-Κ β 免疫组化染色显示正常对照组犬肺组织中JAK-STAT和NF-Κ β不表达或弱阳性表达（见图1A和图1C）；感染组犬肺组织可见JAK-STAT和NF-Κ β阳性细胞，免疫阳性物质呈棕褐色，NF-Κ β在肺气道处表达多，STAT在肺实质处表达多 （见图1B和图1D），感染组和正常组之间存在显著性差异（χ2=476，χ2=521，P ＜0.05），有统计学意义（表 1）。

2.2.2 犬肝组织中 JAK-STAT和NF-Κ β 免疫组化染色显示正常对照组犬肝组织中JAK-STAT和NF-Κ β不表达或弱阳性表达（图 2A 和图 2C）；感染组犬肝组织可见JAK-STAT和NF-Κ β阳性细胞，免疫阳性物质呈棕褐色，以肝细胞坏死区最为明显，胞质和胞核中均可见阳性表达（图2B和图2D）。感染组和正常组之间存在显著性差异（χ2=405，χ2=434，P ＜0.05），有统计学意义（表1）。

3 讨 论

斯氏并殖吸虫病是肺吸虫的童虫在人体内移行或寄居所引起的疾病。成虫寄生于犬、猫、果子狸等终宿主肺部，产出的虫卵随痰吞咽后随粪便排出，在水中发育孵出毛蚴，侵入拟钉螺发育，形成许多尾蚴逸出螺体，再侵入淡水蟹体内发育成囊蚴。当人生食或半生食含囊蚴的淡水蟹后，在小肠内受到消化液作用，幼虫脱囊而出，幼虫钻过肠壁，侵入腹腔窜扰，较少发育成虫，而是以幼虫状态移行至肝、胸腔、心包、睾丸、皮下组织，或经纵隔，进入颅内形成脑型肺吸虫病。斯氏并殖吸虫病的致病作用主要由童虫移行的机械性损伤、虫体代谢产物等抗原物质导致的免疫病理反应引起，出现皮肤型、内脏型肺吸虫病[5]。

图1 犬肺组织 NF-Κ β和JAK-STAT免疫组化染色表现图1A.正常对照组犬肺NF-Κ β在肺实质处低阳性表达图1B.斯氏并殖吸虫感染犬肺组织，NF-Κ β在肺气道处阳性表达图1C.正常对照组犬肺JAK-STAT在气道处低阳性表达图1D.斯氏并殖吸虫感染犬肺组织，JAK-STAT在肺实质处阳性表达Fig.1 Expression of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the lung tissueFig.1A NF-Κ β low expression in the lung of the normal control dogFig.1B NF-Κ β positive expression in the lung of the dog infected with Pagumogonimus skrjabiniFig.1C JAK-STAT low expression in the lung of the normal control dogFig.1D JAK-STAT positive expression in the lung of the dog infected with Pagumogonimus skrjabini

图2 犬肝组织NF-Κ β和JAK-STAT免疫组化染色表现图2A.正常对照组犬肝组织NF-Κ β低阳性表达图2B.斯氏并殖吸虫感染犬肝组织NF-Κ β阳性表达图2C.正常对照组犬肝组织JAK-STAT低阳性表达图2D.斯氏并殖吸虫感染犬肝组织JAK-STAT阳性表达Fig.2 Expression of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the liver tissueFig.2A NF-Κ β low expression in the liver of the normal control dogFig.2B NF-Κ β positive expression in the liver of the dog infected with PagumogonimusskrjabiniFig.2C JAK-STAT low expression in the liver of the normal control dogFig.2D JAK-ST AT positive expression in the liver of the dog infected with Pagumogonimusskrjabini

JAK-STAT信号通路是一条细胞内信号转导通路，可将细胞膜感受到的信号直接传递至核内，启动基因转录。细胞外可溶性信号分子（细胞因子、生长因子等）识别并与细胞膜上的特异性受体结合后诱导受体聚化形成二聚体或三聚体。在胞质内形成高亲和力的JAKs结合位点，JAKs与该结合位点结合后发生自身磷酸化或与受体交叉酪氨酸磷酸化而活化。活化的JAKs进一步募集胞质内相应信号传递给 STAT s，使 STATs二聚化、活化、发生核易位，结合至相应基因启动子区，启动基因表达，从而发挥多种生物学效应。目前已知有多种细胞因子，如 TNF-a、IL-6、IL-1B、干扰素（IFN）等和生长因子是通过活化 JAK-STAT通路进行信号转导的[6]。肺吸虫病时肺、肝是炎症反应最为活跃器官，是炎症和免疫细胞聚集的重要部位。肝脏是机体合成免疫效应分子的主要部位之一，合成过程与JAK-STAT信号通路密切相关。本实验通过建立肺吸虫病模型，以免疫组化染色检测JAK-STAT在肝组织中的定位和表达。观察到正常对照组犬肝组织中JAK-STAT低阳性表达；肺吸虫感染组，JAK-STAT信号通路被激活，活化的STAT发生核易位，直接激活目的基因表达，此时肺、肝功能和大体、组织学表现均出现异常，与JAK-STAT表达和分布的动态变化相一致，提示肺吸虫病时JAK-STAT的表达和活化在肺、肝损伤过程中可能发挥重要作用，JAKSTAT通路参与了肺吸虫病肺、肝损伤的病理过程。

表1 斯氏并殖吸虫感染犬肺、肝 NF-Κ β和JAK-STAT免疫组化检测结果Table 1 Results of detection of NF-Κ β and JAK-STAT by immunohistochemistry in the lung，liver of the dogs with paragonimiasis skrjabini

存在于真核生物中的核转录因子-Κ β，静息时与其抑制蛋白IΚ β结合，以失活状态存在细胞质中，体内外的多种刺激，如缺氧、缺血、氧化应激，炎症反应等均可激活NF-Κ β，当受到激活蛋白激酶刺激时，IΚ β 磷酸化 ，泛 素化 ，降解 ，使 NF-Κ β游离 于胞 浆中，迅速发生核移位，通过它的核定位信号与DNA上相应的Κ β位点特异结合，促进相关基因转录[4]。肺吸虫感染，NF-Κ β 在损伤的肺 、肝中持续活化，通过许多潜在途径诱导细胞死亡；而且NF-Κ β可诱导IL-1、ICAM-l、iN0S 、TNF-a 表达和钙超载 、氧自由基的形成，加重肺、肝组织损害。

本实验通过腹腔注射斯氏并殖肺吸虫囊蚴感染犬，建立肺吸虫病模型，取犬肺、肝组织标本；通过HE染色、光镜观察到肺吸虫感染犬的肺、肝组织细胞病理改变以及炎症细胞反应状况；通过免疫化学染色方法检测JAK-STAT和NF-Κ β炎症信号通路表达，肺吸虫感染犬肺、肝组织的实质细胞和炎症细胞呈现阳性表达，正常对照犬阳性表达较低，二者存在显著差异，具有统计学意义；肺吸虫病的机械破坏和炎症病理反应多种刺激，造成组织缺氧、缺血、氧化应激，炎症反应等均可激活JAK-STAT和 NFΚ β表达 ，说明 JAK-STAT 和 NF-Κ β炎症信号通路可能参与了肺吸虫病肺、肝组织的病理过程，为以后我们深入肺吸虫病的防治和基础实验研究奠定基础。

[1]Blair D，Agatsuma T，Watanabe T，etal.Geographical genetic structure within the human lung fluke，Parag onimus westermani，detected from DNA sequences[J].Parasitology，1997，115（4）：411-417.

[2]Lee JC，Cho GS，Kwon JH，etal.Macrophageal/microglial cell activation and cerebral injury induced by ex cretory secretory products secreted by Paragonimus westermani[J].Neuroscience Research，2006，54（2）：133-139.

[3]廖新学，孙胜楠，郭瑞鲜，等.JAK-STAT 通路调制NF-Κ β 介导H2O2预处理的细胞保护作用[J].中国病理生理杂志，2008，24（7）：1422-1427

[4]李军，娄季宇，杨霄鹏.雌激素对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织NF-κ B、iNoS表达和细胞凋亡的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2009，12（18）：15-16

[5]詹希美.人体寄生虫学[M].北京：人民卫生出版社，2005.

[6]Espert L，Dusanter-Fourt I，Chelbi-Alix M K.Negative regulation of the JAK/STA T：pathway implication in tumorigenesis[J].Bull Caner，2005，92（10）：845-847.