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西罗莫司对人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的影响及其机制

2011-09-20张玉泉

实用临床医药杂志 2011年21期
关键词:培养液引物内膜

金 阳,张玉泉

(1.江苏省常州市妇幼保健院妇产科,江苏常州,213000;2.江苏省南通大学附属医院妇产科,江苏南通,226000)

由于肿瘤细胞的失控性生长导致耗氧量的增加,缺氧成为肿瘤细胞生长的基本环境,肿瘤细胞如何适应这一微环境并保持持续生长已成为肿瘤研究的中心问题。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,由HIF-1α和HIF-1β亚基组成,HIF-1α是唯一的氧调节亚单位,决定HIF-1的活性[1],而HIF-1直接调控血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达,是恶性肿瘤诱导新生血管形成的主要调控因子。西罗莫司(SRL)是从吸水性链霉菌发酵液中提取出的一种大环内酯类抗生素,研究显示SRL不仅有抗移植免疫排斥反应作用,而且还有广泛的抗肿瘤作用[2-3]。本文用氯化钴(CoCl2)化学模拟诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞内缺氧,再加不同浓度SRL培养,观察细胞内mTOR、HIF-1α表达变化,并对其发生机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

人子宫内膜癌细胞Ishikawa株(湘雅中心实验室);西罗莫司(SLR,上海宝曼生物科技有限公司);DMEM(高糖)培养基(美国 Invitrogen公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RISOTM RNA ISOlation Reagent、EzOmicsTM RNA i-step qPCR Kit(百奥迈科生物技术有限公司);兔抗人mTOR多克隆抗体(Bioworld公司);兔抗人 HIF-1α多克隆抗体(博士德公司);CCK8细胞增殖毒性试剂盒;PCR引物及GAPD H内参(百奥迈科生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养

将人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞接种于含10%FBS的DMEM 培养基,37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,进入对数生长期后,传代于6孔细胞培养板中,选择生长良好的肝癌细胞用于实验。

1.3 实验分组

对照组用培养液培养48 h,实验组用培养液培养24 h后,用含不同浓度CoCl2的培养液处理细胞24 h,根据CoCl2浓度不同分为 5个亚组(0、25、50 、100 和 150 μ mol/L 组);选择CoCl2 浓度为100μ mol/L来模拟肿瘤内缺氧微环境 ,用培养液培养细胞24 h后,对照组继续培养液培养48 h,实验组用含SRL 分别为 0、10、100、500、1 000 nmol/L的1 μ mol/L的CoCl2培养液培养48 h。

1.4 RT-PCR法测定经CoCl2处理后,各组细胞中HIF-1α mRNA的相对表达量

应用荧光定量PCR仪MyIQ(Bio-Rad公司)做 RT-PCR分析。用 RISOTM RNA ISOlation Reagent提取总的 RNA。用 EzOmicsTM RNA i-step qPCR Kit一步法进行PCR扩增,同时扩增磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照。HIF-1α引物序列(107 bp):上游5′-GCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3′, 下 游 5′ -TGCAGTAGGTTTCTGCTGCC-3′;GAPDH 引物序列(225 bp):上游 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下 游 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反应体系为 25 μ L:RNA 5μ L,2 × Master Mix 12.5 μ L,Primer F′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,Primer R′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,DEPC-treated H2O6μ L 。 一步法PCR条件:42℃反转录60 min;95℃预变性10 min;95℃20 s,55℃20 s,72℃30 s,45个循环;扩增产物的熔解曲线分析程序:95℃1 min、55℃1 min,然后逐渐升至95℃(温度转换率为0.1℃/s,持续收集荧光数据)。选择适宜的基线,各荧光曲线和基线的交叉点即为Ct(cycle threshold)值,Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比,样品中起始模板数越多,PCR越快进入对数扩增期,Ct越小。采用“比较 Ct值法”(Ct)分析荧光定量数据,按照 Livak和Schimittgen设计并推导出的公式计算基因的相对表达量=2—Ct,其中Ct=(Ct目的基因-CtGAPDH)实验组-(Ct目的基因-Ct-GAPDH)对照组,可计算出处理组基因的表达相对于对照组的变化倍数。

1.5 CCK-8法测定缺氧条件下SLR作用于Ishikawa细胞的细胞活力

收集处于对数生长期的 Ishikawa细胞接种于一次性96孔培养板,置于37℃、5%CO2培养箱培养24 h,次日待细胞贴壁后加入浓度为100 μ mol/L 的 CoCl2和不同浓度的 SLR(10、100、500、1 000 nmol/L),终末体积为 100 μ L,每个浓度设6个复孔,每块96孔板上另接种1孔只加培养液调零。继续培养48 h,每孔加入同一批次的CCK-8作用2 h。选择450 nm波长,调零后在酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(D值),按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均D值/对照组平均D值)×100%,计算SLR作用于缺氧条件下的Ishikawa细胞的抑制率。实验重复3次。

1.6 FQ-PCR测定缺氧条件下SRL作用于各组细胞内的mTOR、HIF-1α、mRNA 的相对表达量

应用荧光定量PCR仪MyIQ(Bio-Rad公司)做实时定量 PCR分析。用 RISOTM RNA ISOlation Reagent提取总的 RNA。用 EzOmic-sTM RNA i-step qPCR Kit一步法进行PCR扩增,同时扩增磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照。HIF-1α引物序列(107 bp):上游 5′-GCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3′,下游5′-TGCAGTAGGTTTCTGCTGCC-3′;mTOR 引物序列(133 bp):上游 5′-AGCGAGGAGCTGA TCCGAGT-3′,下游 5′-TAGCATGCAAGGG CTCCAGC-3′;GAPDH 引物序列(225bp):上游 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′, 下游5′-GAAGATGGTGATGGGAT TTC-3′。 PCR反应体系为 25 μ L:RNA 5 μ L,2 ×Master Mix 12.5 μ L,Primer F′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,Primer R′(Stock:10 μ mol/L)0.5 μ L,DEPC-treated H2O6μ L。一步法PCR条件:42℃反转录60 min;95℃预变性10 min;95℃20 s,55℃20 s,72℃30 s,45个循环;扩增产物的熔解曲线分析程序:95℃1 min、55℃1 min,然后逐渐升至95℃(温度转换率为0.1℃/s,持续收集荧光数据)。计算方法同1.4。

2 结 果

2.1 不同剂量CoCl2对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞中HIF-1α mRNA表达的影响

HIF-1α mRNA 在 0、25、50、100 和 150 μ mol/L的CoCl2处理组表达强度分别为1.00±0.08 、3.48±0.56、6.59±0.13、14.66±0.69 、15.76±0.88,随着 CoCl2的浓度的升高 HIF-1α mRNA表达增强,差异有统计学意义(P<0.05),其中 CoCl2浓度为 100和 150 μ mol/L 的两组比较,差异无统计学意义(P=0.163;P>0.05),因此选用100 μ mol/L模拟肿瘤内缺氧微环境。FQ-PCR检测HIF-1α基因及内参照基因GAPDH的融解曲线和扩增曲线。

2.2 CCK-8法测定缺氧条件下SLR对Ishikawa细胞增殖的影响

不同浓度(10、100、500、1000 nmol/L)的SLR对Ishikawa细胞的抑制率(图1)分别为:(38.95±1.89)%、(48.38±6.4)%、(65.65±0.90)%和(68.12±2.87)%。SLR对Ishikawa细胞有抑制作用,且其抑制率随药物浓度的增加而上升,差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 缺氧条件下SLR对Ishikawa细胞的抑制率

2.3 不同剂量的SRL对子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞中 mTOR,HIF-1α mRNA表达的影响

mTOR mRNA 在含 SRL 分别为0、10、100、500、1 000 nmol/L 的 100 μ mol/L 的 CoCl2培养液处理组中的表达强度分别为1.18±0.30、0.87±0.12、0.85±0.11 、0.56±0.06、0.27 ±0.04;在常规培养条件下表达强度为1.00±0.20。HIF-1α mRNA 在含 SRL 分别为 0、10、100 、500、1 000 nmol/L的100 μ mol/L的CoCl2培养液处理组中的表达强度分别为5.20±0.96、4.19±0.42、3.71±0.59、3.41±0.31和2.68±0.16;在常规培养条件下表达强度为1.00±0.10。mTOR mRNA在缺氧对照组细胞中的表达相对于常氧对照组差异无统计学意义(P=0.743;P>0.05);常氧组细胞内HIF-1α mRNA的表达较弱,缺氧对照组细胞内HIF-1α mRNA的表达明显增强,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。在缺氧条件下,在不同药物浓度组中,随着SRL作用浓度的增加,HIF-1α、mTOR mRNA的表达水平呈下降趋势,且抑制作用与药物浓度显著相关(P<0.05)。当SRL的作用浓度达1 000 nmol/L时,SRL对mTOR和HIF-1α mRNA的抑制效应达到最大。FQ-PCR检测 mTOR、HIF-1α基因及内参照基因GAPDH的融解曲线和扩增曲线。

3 讨 论

子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是起源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤,是妇科生殖道最常见的恶性肿瘤之一,现在许多国家,内膜癌发病率已超过宫颈癌而跃居女性生殖道恶性肿瘤的首位。目前,治疗子宫内膜癌的方法以手术治疗为主,辅以激素治疗、化疗、放疗等。早期子宫内膜癌以手术治疗为主,治愈率达70%。晚期和复发性的子宫内膜癌以激素及化疗等姑息治疗为主。然而治疗效果仍不够理想,因此,十分有必要探求一种新型的治疗方法,以改善子宫内膜癌的临床结局。

HIF-1是在研究红细胞生成素(EPO)基因表达时发现的核转录因子[4]。HIF-1是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,调控着下游众多基因的转录和表达,是介导细胞对缺氧微环境进行适应性反应的转导调控因子[5],由HIF-1α和HIF-1β亚基组成异源二聚体的转录因子,其中HIF-1α是主要活性单位,其表达受氧分压调节HIF-1α感受缺氧信号后,自身被迅速激活,进入核内与其他转录因子协同作用并结合到缺氧相关基因的调控元件,调控相关基因的表达,以维持细胞和机体的氧自稳平衡能量代谢平衡。而缺氧是实质性肿瘤物理微环境之一,所以HIF-1α对于肿瘤的生长尤为重要。

本实验研究基于化学缺氧剂剂量准确可控、不要特殊设备、易操作等优点,以CoCl2化学缺氧模拟细胞内缺氧微环境,这里CoCl2的作用与低氧一致,Co2+是亚铁螯合酶的底物,可取代细胞中的Fe2+与血红素结合,使原卟啉 Ⅸ与O2分子的结合能力下降,阻断O2信号的传递 ,导致细胞内环境处于缺氧状态,诱导HIF-1α的表达。同时,Co 2+还能通过替代作为脯氨酰羟化酶(PHD)辅助因子的Fe2+,抑制PHD对HIF-1α的羟基化作用,减少HIF-1α的降解[6]。本研究结果显示 ,利用低浓度的CoCl2预处理细胞,HIF-1α的表达随着缺氧程度的增高而增强 ,提示无论在常氧还是低氧条件下,HIF-1α在人子宫内膜癌Ishikawa细胞中均有表达 ,且随着Co-Cl2浓度的增高,即缺氧信号的加强(实质性肿瘤发展越快,氧供的不平衡就越明显),其mRNA表达水平上调。因此,我们认为一方面CoCl2是一种较好的模拟缺氧复氧的药物[7],另一方面也说明本研究成功地复制了缺氧模型。其可能的机制为:当氧需求量绝对或相对增加,肿瘤细胞可通过启动缺氧应答的开关“HIF-1”,使其表达上调,最终启动一系列下游基因转录,其产物使肿瘤细胞适应缺氧的应激状态继续存活和增殖。

SLR是一种大环内酯类化合物,具有抗真菌和增强免疫抑制活性的作用 ,目前作为免疫抑制剂广泛应用于临床。最近研究结果显示,SRL具有广泛的抗肿瘤作用 ,如抗胰腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、肾癌等。SLR在哺乳动物细胞内的靶点是mTOR,它进入细胞后与FKBP12结合,形成一种“功能获得性”复合物-rapamycin/FKBP12,强烈抑制mTOR的蛋白激酶催化活性,使之对其下游底物的磷酸化调节作用减弱或消失[8-10]。SLR阻断mTOR信号途径后,可使15%~20%的蛋白翻译受到抑制并干扰细胞周期蛋白产物的表达和细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的活性,使细胞周期在G1后期-S期被阻断从而导致细胞周期阻滞。SRL通过特异性抑制mTOR而抑制HIF-1α的激活,可有效下调HIF-1α基因的表达,既能抑制HIF-1α基因的合成又能增加其降解,并能下调HIF-1α基因调控的其他基因的表达[11]。本实验结果显示,SRL对Ishikawa细胞有生长抑制作用,能明显使Ishikawa 细 胞 mTOR,HIF-1α mRNA 表 达 下降,且随着 SRL浓度的升高,Mtor、HIF-1α mRNA表达呈下降趋势。由此推测,SRL可以通过上述信号途径 ,阻断 Ishikawa细胞表达HIF-1α mRNA,进而抑制其下游基因VEGF等的表达,从而抑制肿瘤的发生发展,这可能是其抗肿瘤的机制之一。

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